其也未与一种或多种纤维素酶基因和/或一种或多种半纤维素酶基因 共表达。在合适微生物中的表达使得其可以比β-葡糖苷酶在未工程化微生物中内源表达 时或在植物中表达时实质上更大的量表达这些可用的β -葡糖苷酶，所述合适微生物经过 多年开发，在大量遗传工具帮助下，已成为异源蛋白和酶的高度有效且高效的生产者。归类 为β-葡糖苷酶的酶不仅在其来源上而且在其对木素纤维素底物的活性上各不相同，但大 多数（如果不是全部的话）葡糖苷酶可在合适的条件下催化纤维二糖水解。例如，一些 不仅对纤维二糖有活性，而且对较长链的低聚糖有活性，而其他则更专一地仅对纤维二糖 有活性。即便对于那些具有类似底物偏好性的葡糖苷酶而言，一些也具有使其催化活 性更大且更高效的酶动力学曲线，并且相应地更加适用于酶催化的水解不能做到持续长于 至多数天的工业应用。此外，尚未对能够转化从木素纤维素生物质的酶法水解获得的纤维 素糖的发酵或产乙醇微生物进行工程改造，以表达来自粗糙脉孢菌的β -葡糖苷酶，诸如 本文的Nc3A多肽。β -葡糖苷酶在产乙醇微生物中的表达提供了重要的机会以进一步从未 被酶糖化完全转化的剩余纤维二糖释放D-葡萄糖，其中由此产生的D-葡萄糖可被产乙醇 生物立即消耗或及时发酵。
[0014] 本发明组合物和方法的一方面涉及来源于粗糙脉孢菌的糖基水解酶家族3的 β-葡糖苷酶多肽（本文称为"Nc3A"或"Nc3A多肽")、编码其的核酸、包含其的组合物、以及 产生β-葡糖苷酶多肽和包含其的组合物及将β-葡糖苷酶多肽和包含其的组合物应用于 将木素纤维素生物质水解或转化成水溶性的可发酵糖的方法。然后可将此类可发酵糖转化 成纤维素乙醇、燃料以及其他生物化学物质和可用产物。在某些实施例中，与基准里氏木霉 Bgll(其是已知的高保真性β-葡糖苷酶）相比，Nc3Af3-葡糖苷酶多肽具有更高的β-葡 糖苷酶活性和/或表现出增强的水解给定木素纤维素生物质底物的能力。（Chauve，Μ. et al.，（2010) Biotechnol. Biofuels, 3 (I) : 3 (Chauve, Μ·等人，2010 年，《生物燃料技术》，第 3 卷，第1期，第3页））。
[0015] 在一些实施例中，将Nc3A多肽与酶组合物中的一种或多种其他纤维素酶一起或 在存在酶组合物中的一种或多种其他纤维素酶的情况下施加以水解或分解合适的生物质 底物。所述一种或多种其他纤维素酶可为例如其他β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和/或内 切葡聚糖酶。例如，酶组合物可包含Nc3A多肽、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在一些 实施例中，将Nc3A多肽与酶组合物中的一种或多种半纤维素酶一起或在存在酶组合物中 的一种或多种半纤维素酶的情况下施加。所述一种或多种半纤维素酶可为例如木聚糖酶、 β -木糖苷酶和/或L-阿拉伯呋喃糖苷酶。在另外的实施例中，将Nc3A多肽与酶组合物中 的一种或多种纤维素酶和一种或多种半纤维素酶一起或在存在酶组合物中的一种或多种 纤维素酶和一种或多种半纤维素酶的情况下施加。例如，酶组合物包含Nc3A多肽、无或一 种或两种其他β -葡糖苷酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种内切葡聚糖酶；任选 地无或一种或多种木聚糖酶、无或一种或多种β -木糖苷酶、以及无或一种或多种L-阿拉 伯呋喃糖苷酶。
[0016] 在某些实施例中，在存在产乙醇微生物的情况下，将Nc3A多肽或包含Nc3A多肽的 组合物施加到木素纤维素生物质底物或部分水解的木素纤维素生物质底物，所述产乙醇微 生物能够代谢通过木素纤维素生物质底物的酶法水解所产生的可溶性可发酵糖，并将此类 糖转化成乙醇、生物化学物质或其他可用的材料。这种过程可为严格的顺序过程，其中水解 步骤在发酵步骤之前进行。这种过程可另选地为混合过程，其中水解步骤首先开始，但在一 段时间内与稍后开始的发酵步骤重叠。这种过程可在另外一种替代形式中为同步水解和发 酵过程，其中生物质底物的酶法水解在产乙醇生物发酵由酶法水解产生的糖的同时进行。
[0017] Nc3A多肽例如可为酶组合物的一部分，从而促进酶法水解过程和从低聚糖诸如纤 维二糖释放D-葡萄糖。在某些实施例中，Nc3A多肽可被遗传工程改造而在产乙醇生物中表 达，使得产乙醇微生物表达和/或分泌此种葡糖苷酶活性。此外，Nc3A多肽可为水解酶 组合物的一部分，与此同时也可由产乙醇生物表达和/或分泌，其中使用水解酶组合物水 解木素纤维素生物质底物所产生的可溶性可发酵糖被也表达和/或分泌Nc3A多肽的产乙 醇微生物代谢和/或转化成乙醇。除一种或多种其他纤维素酶和/或一种或多种半纤维素 酶之外，水解酶组合物还可包含Nc3A多肽。产乙醇生物可被工程改造，使得其表达Nc3A多 肽、一种或多种其他纤维素酶、一种或多种其他半纤维素酶、或这些酶的组合。β -葡糖苷酶 中的一种或多种可在水解酶组合物中并由产乙醇生物表达和/或分泌。例如，可使用包含 Nc3A多肽的酶组合物实现木素纤维素生物质底物的水解，并且然后可用经工程改造而表达 和/或分泌Nc3A多肽的微生物来发酵由水解产生的糖。作为另一种选择，包含第一 β-葡 糖苷酶的酶组合物参与水解步骤，并且产乙醇生物表达和/或分泌与第一 β -葡糖苷酶不 同的第二β-葡糖苷酶。例如，可使用包含里氏木霉Bgll的水解酶组合物实现木素纤维素 生物质底物的水解，并且通过表达和/或分泌Nc3A多肽的产乙醇微生物来发酵由水解产生 的可发酵糖，或反之亦然。
[0018] 如本文所展示，Nc3A多肽和包含Nc3A多肽的组合物在发生木素纤维素生物质的 糖化和降解的条件下具有改善的功效。当将包含Nc3A多肽的酶组合物水解给定生物质底 物的性能与包含里氏木霉Bgll的另外相当的酶组合物相比时，包含Nc3A多肽的酶组合物 显示出改善功效。在一些实施例中，生物质底物为磷酸溶胀纤维素（PASC)，例如使用如下文 献的修改方案预处理的Avicel :Walseth，TAPPI 1971，35:228 (Walseth，《纸浆与造纸工业 技术协会志》，1971 年，第 35 卷，第 228 页）和 Wood, Biochem. 1971，121:353-362 (Wood， 《生物化学杂志》，1971年，第121卷，第353-362页）。在一些其他实施例中，生物质底物 为稀氨水预处理的玉米秸杆，例如国际公布的专利申请：W02006110891、W02006110899、 TO2006110900、W02006110901 和 W02006110902 ;美国专利 No. 7, 998, 713、Νο· 7, 932, 063 中 所述的玉米秸杆。
[0019] 在某些实施例中，改善或增强的β -葡糖苷酶活性反映于Nc3A多肽的改善或增 强的纤维二糖酶活性中，所述纤维二糖酶活性使用纤维二糖作为底物例如在约30°C至约 65°C (例如，约35°C至约60°C、约40°C至约55°C、约45°C至约55°C、约48°C至约52°C、 约40°C、约45°C、约50°C、约55°C等）的温度下测得。在一些实施例中，当使用β-葡糖 苷酶多肽水解磷酸溶胀纤维素（PASC)时，观察到与里氏木霉Bgll相比，Nc3A多肽具有改 善的β -葡糖苷酶活性，所述磷酸溶胀纤维素例如为使用如下文献的修改方案预处理的 Avicel :Walseth, TAPPI 1971，35:228 (Walseth，《纸浆与造纸工业技术协会志》，1971年，第 35 卷，第 228 页）和 Wood, Biochem. J. 1971，121:353-362 (Wood，《生物化学杂志》，1971 年， 第121卷，第353-362页）。在一些实施例中，当使用β-葡糖苷酶多肽水解稀氨水预处理 的玉米秸杆时，观察到与里氏木霉Bgll相比，Nc3A多肽具有改善的β -葡糖苷酶活性，所 述稀氨水预处理的玉米秸杆例如为国际公布的专利申请：W02006110891、W02006110899、 TO2006110900、W02006110901 和 W02006110902 ;美国专利 No. 7, 998, 713、Νο· 7, 932, 063 中 所述的玉米秸杆。
[0020] 在一些方面，Nc3A多肽和/或在施加在酶组合物中或方法中以水解木素纤维素生 物质底物时为（a)源自、可得自或产生自粗糙脉孢菌；(b)包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸序 列具有至少 80% (例如，至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100% )同一性的氨基酸序列的重组多肽；（c)包含与SEQ ID N0:2的催化结 构域即第19-875位氨基酸残基具有至少80% (例如，至少80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列的重组多肽；（(1)包 含与SEQ ID N0:3的氨基酸序列的成熟形式即SEQ ID N0:2的第19-875位氨基酸残基具 有至少 80% (例如，至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100% )同一性的氨基酸序列的重组多肽；或（e)具有β -葡糖苷酶活性的（a)、(b)、 (c)或（d)的片段。在某些实施例中，提供了具有β-葡糖苷酶活性的变体多肽，其包含SEQ ID NO:2的一个或多个氨基酸残基的置换、缺失和/或插入。
[0021] 在一些方面，Nc3A多肽和/或在施加在酶组合物或方法中以水解木素纤维素生物 质底物时为（a)由与SEQ ID N0:1具有至少80% (例如，至少80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的核酸序列所编码的多肽、 或（b)在中等严格条件、高度严格条件或极高严格条件下杂交于SEQ ID NO: 1或杂交于至 少100个连续核苷酸的SEQ ID N0:1的子序列或杂交于其互补序列的多肽，其中多肽具有 β -葡糖苷酶活性。在一些实施例中，Nc3A多肽和/或在施加在组合物或方法中以水解木 素纤维素生物质底物时为这样的多肽，其由于遗传密码的简并性，不会在中等严格条件、高 度严格条件或极高严格条件下杂交于SEQ ID NO: 1或杂交于至少100个连续核苷酸的SEQ ID NO: 1的子序列，但不过会编码具有β-葡糖苷酶活性并包含与SEQ ID N0:2的氨基酸 序列或与SEQ ID N0:3的成熟β-葡糖苷酶序列具有至少80% (例如，至少80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)同一性的氨基酸序列 的多肽。核酸序列可为合成的，并且不一定来源于粗糙脉孢菌，但核酸序列编码具有β-葡 糖苷酶活性的多肽并且包含与SEQ ID NO: 2或与SEQ ID NO: 3具有至少80%同一性的氨基 酸序列。
[0022] 在一些优选的实施例中，与野生型里氏木霉Bgll(序列为SEQ ID N0:4)或包含 里氏木霉Bgll的酶组合物相比，Nc3A多肽或包含Nc3A多肽的组合物具有改善的β-葡糖 苷酶活性。在某些实施例中，如使用氯-硝基-苯基-葡糖苷（CNPG)水解测定法测量的，