心管中充分混匀后，再加入50ml1倍CTAB提取缓冲液。其中，2倍CTAB提取缓冲液包括： 2%CTAB(十六烷三甲基溴化铵），100mMTris(三羟甲基氨基甲烷），20mMEDTA(乙二胺四 乙酸二钠PH8. 0)，1. 4MNaCl，1 %PVP(聚乙烯基吡咯烷酮）Mw40, 000 ; 1倍CTAB缓冲液（2 倍CTAB提取缓冲液用双蒸水稀释1倍）。
[0046]2.在55~65°C恒浴30min，加入150ml氯仿：异戊醇（24:1)，充分摇动5min， 8000r/min，室温下5min离心。
[0047] 3.取上清液加入1/10体积的10 %的CTAB缓冲液，加入200ml氯仿：异戊醇 (24:1)，充分摇动5min，4000r/min，室温下离心5min。
[0048] 4.上清加入0. 6倍体积的异丙醇，室温下30min，5000转，4°C离心5min。沉 淀用0. 8ml高盐缓冲液充分溶解，15000r/min离心2min，其中，高盐缓冲液包括：10mM Tris(pH8. 0)，ImMEDTA(pH8. 0)，1MNaCl(氯化钠）。
[0049] 5.上清加入0. 6倍体积的异丙醇，室温下30min，5000转，4°C离心5min。沉淀用 4ml双蒸水溶解，加入2. 5倍体积95%的冷乙醇，-20°C冰箱中2h以上，15000转离心20min。
[0050] 6.沉淀用70%的冷乙醇洗一次，自然干燥后，用2000y1 0. 1倍TE缓冲液溶解， 加入200y1RNA酶贮存缓冲液（lmg/ml)，37°C，一小时降解RNA。其中，1倍TE缓冲液包 括：10mMpH值为8. 0的Tris、lmMpH值为8. 0的EDTA;RNA酶贮存缓冲液包括：lmg/ml RNaseA，100U/mlRNaseTl,沸水中处理3分钟，冰箱中保存。
[0051] 7.紫外吸收光谱法检测DNA的浓度和纯度。DNA浓度的检测采用紫外吸收光谱法。 DNA溶液260的OD值为1，相当于在约50yg/ml双链DNA，40yg/ml单链DNA，DNA浓度双 链DNA样品浓度（yg/y1) = 0D260X核酸稀释倍数X50。（A260/A280 彡 1. 8,A260/ A230彡2. 0表明DNA纯度符合质量要求。
[0052] 8.用限制性内切酶HindIII.+EcoRI酶切DNA，电泳检测。用琼脂糖凝胶电泳 检测其分子量的分布范围，酶切完整的DNA呈弥散状。酶切后的DNA用2. 5倍体积95% 的冷乙醇，-40°C冰箱中过夜，15000转离心20min。沉淀干燥后用1倍SS缓冲液溶解，浓 度为100-200yg/ml，其中，1倍SSC缓冲液包括：150mMNaCl，15mMC6H9Na309(柠檬酸三钠 pH8. 0) 〇
[0053] 实施例2野生菰DNA的导入及后代选择
[0054] 1.导入受体的选择
[0055] 受体应选择综合性状好，只有少数或个别性状需要改良的品种或品系。
[0056] 2?导入时间和方法
[0057] 在水稻开花1~3h，切柱头1/3~2/3,然后在切口处滴入DNA溶液，浓度为 100-200yg/ml。浸泡去掉柱头的子房，及时套袋。待种子成熟时收获D^代种子。
[0058] 3.野生菰整体DNA和酶切野生菰DNA导入水稻的变异率分析
[0059] 采用步骤2的方法，将实施例1步骤7获得的野生菰整体DNA和步骤8获得的酶 切野生菰DNA分别导入水稻品种湘晚籼12号和湘早籼45号中。
[0060] 2003年，采用野生菰整体DNA导入方法，湘晚籼12号共导入500粒，获得种子123 粒，后代发现变异株6株，变异率为4. 9 % ;湘早籼45号共导入400粒，获得种子128粒，后 代发现变异株6株，变异率为4. 7 %。
[0061] 2003年，采用酶切野生菰DNA导入，湘晚籼12号共导入500粒，获得种子125粒， 后代发现变异株17株，变异率为13.6% ;湘早籼45号共导入400粒，获得种子122粒，后 代发现变异株16株，变异率为13. 1 %。
[0062] 2004年，采用野生菰整体DNA导入方法，湘晚籼12号共导入500粒，获得种子126 粒，后代发现变异株5株，变异率为4. 0% ;湘早籼45号共导入400粒，获得种子128粒，后 代发现变异株7株，变异率为5. 5 %。
[0063] 2004年，采用酶切野生菰DNA导入，湘晚籼12号共导入500粒，获得种子124粒， 后代发现变异株18株，变异率为14. 5% ;湘早籼45号共导入400粒，获得种子132粒，后 代发现变异株17株，变异率为12. 9%。
[0064] 结果参见表1，表1为本发明实施例提供的育种方法的变异率。
[0065] 表1本发明实施例提供的育种方法的变异率
[0066]
【主权项】
1. 一种水稻的育种方法，包括以下步骤： a) 采用CTAB法提取野生菰DNA ; b) 用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，获得酶切野生菰DNA ; c) 采用花粉管通道法将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育 种。
2. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述限制性内切酶为Hind III.和 EcoR I 〇
3. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤a)具体为： al)取野生菰幼叶，用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，加入1倍CTAB缓冲 液，55-65°C 恒浴 30min ; a2)向步骤al)获得的溶液中加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混合后离心； a3)向步骤a2)获得的上清液中加入CTAB缓冲液、体积比为24:1的氯仿和异戊醇，混 合后离心； a4)向步骤a3)获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离 心； a5)向步骤a4)获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀用双蒸水溶解，加入2. 5 倍体积95%冷乙醇-40°C冰箱中沉淀2h后离心； a6)将步骤a5)获得的沉淀用冷乙醇洗一次，自然干燥后，用TE缓冲液溶解，加入RNA 酶贮存缓冲液处理后，获得野生菰DNA。
4. 根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，所述2倍CTAB提取缓冲液包括：2% CTAB、100mMTris、20mM pH 值为 8. 0 的 EDTA、1. 4M NaCl 和 1% 的分子量为 40000 的 PVP。
5. 根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，所述高盐缓冲液包括：IOmM pH值为 8. 0 的 Tris、ImM pH 值为 8. 0 的 EDTA 和 IM NaCl。
6. 根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于，1倍TE缓冲液包括：IOmM pH值为 8. 0 的 Tris、lmM pH 值为 8. 0 的 EDTA ;RNA 酶贮存缓冲液包括：lmg/mlRNaseA 和 100U/ml RNaseTl0
7. 根据权利要求1或2所述的育种方法，其特征在于，步骤b)包括： 用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，酶切后的DNA用冷乙醇-40°C下过夜， 离心，得到的沉淀干燥后用1倍SSC缓冲液溶解，获得酶切野生菰DNA。
8. 根据权利要求7所述的育种方法，其特征在于，所述1倍SSC缓冲液包括： 150mMNaCl, 15mMpH 值为 8. 0 的 C6H9Na309。
9. 根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述步骤c)为： 在水稻开花1~3h，切柱头1/3~2/3,然后在切口处滴入步骤b)获得的酶切野生菰 DNA溶液，浸泡去掉柱头的子房，将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料 进行育种。
10. 根据权利要求9所述的育种方法，其特征在于，所述酶切野生菰DNA溶液的浓度为 100-200 μ g/ml〇
【专利摘要】本发明提供了一种水稻的育种方法，包括以下步骤：a)采用CTAB法提取野生菰DNA；b)用限制性内切酶酶切步骤a)获得的野生菰DNA，获得酶切野生菰DNA；c)采用花粉管通道法将步骤b)获得的酶切野生菰DNA导入水稻，选择变异材料进行育种。本发明通过限制性内切酶酶切野生菰DNA导入水稻后，后代的变异率比完整DNA导入明显提高，稳定速度快，获得了优良的水稻新株系和新品种。实验结果表明，酶切野生菰DNA导入水稻创新的水稻新品种茎秆粗大，穗大粒多，后期灌浆速度快，克服了大穗而分蘖力弱、包颈、结实率低的缺陷；田间观察未发现严重病虫害危害，是一批极具增产潜力的资源材料。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-87
【公开号】CN104830909
【申请号】CN201510308425
【发明人】田杰
【申请人】田杰
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年6月8日