养于含甘氨酸或丝 氨酸培养基时，发现其与野生型相比生产出更大量的OPS(见表2、3、6和7)。
[0028] 此外，本发明的重组微生物可具有增强的磷酸甘油酸脱氢酶（SerA)或磷酸丝氨 酸氨基转移酶（SerC)活性。SerA为具有将3-磷酸甘油酸转化成3-磷酸羟基丙酮酸的活性 的蛋白质。SerA可具有野生型氨基酸或抗丝氨酸反馈抑制的突变氨基酸序列，但不限于这 些。优选地，SerA可具有选自SEQ ID N0S:3~7中的一种氨基酸序列。只要它表现出野生 型的SerA的活性或抗丝氨酸反馈抑制的突变SerA活性，可使用任意氨基酸序列，但其优选 与SEQ ID N0:3~7中的一种具有90%或以上，更优选96%或以上，还更优选98%或以上， 最优选99%或以上的同源性。"抗反馈抑制的突变SerA"是指不管对丝氨酸或甘氨酸的反 馈抑制，该突变表现出维持或增强的SerA活性。抗反馈突变体是本领域公知的（Grant GA 等人，J. Biol. Chem.，39:5357-5361，1999 ;Grant GA 等人，Biochem.，39:7316-7319, 2000 ; Grant GA 等人，J. Biol. Chem. ,276:17844-17850, 2001 ;Peters_Wendisch P 等人，Appl. Microbiol. Biotechnol.，60:437-441，2002 ;EP0943687B)。在本发明的一个实施方案中，当 进一步向具有受到破坏的serB的谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌中导入抗反馈serA时，发现 其与野生型相比生产更大量的OPS (见表4和9)。
[0029] SerC为具有将3-磷酸羟基丙酮酸转化成0-磷酸丝氨酸的活性的蛋白质。SerC 包括但不限于表现出SerC活性的序列，优选其具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列。然而，只 要它表现出SerC活性，可使用任意氨基酸序列，但优选与SEQ ID N0:8具有90%或以上，更 优选96%或以上，还更优选98%或以上，最优选99%或以上的同源性。此外，可向serC引 入突变，以增加酶活性。在本发明的一个实施方案中，当进一步向具有受到破坏的serB和 抗反馈抑制的SerA的谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌中导入抗反馈serC时，发现其与野生型 相比生产更大量的OPS (见表9)。
[0030] 进一步地，可降低本发明重组微生物进行0-磷酸丝氨酸细胞内摄取或降解的能 力。具体地，可对重组微生物进行改性以降低PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC运载蛋白 (PhnCDE操纵子，即磷酸酯转运蛋白（PhnC ;EG 10713)的ATP结合组分-Pn运载蛋白（PhnD ; EG 10714)的周质结合蛋白组分-烷基磷酸酯ABC运载蛋白（PhnE ;EG11283)的整体膜组 分）、碱性磷酸化酶（PhoA)或酸性磷酸化酶（AphA)的活性。
[0031] 在本发明的一个实施方案中，观察到进一步缺失重组突变体的phnCDE操纵子导 致OPS产量的增加（表10)。在PhoA或AphA活性被进一步受到破坏的重组微生物中，当 培养基中磷酸浓度降低的时候，OPS的降解开始减少（表12)。然而，引入抗反馈的serA或 serC增加了 OPS的产量（表14~16)。
[0032] 同样，本发明的重组微生物进一步的特征在于嘧啶核苷酸转氢酶（PntAB ;EC 1.6. LI)活性的增加。如之前（Sauer U P 等人，J Biol Chem. 20 ;279(8) :6613-9. Epub 2003)所公开的，PntAB参与NADPH代谢，以调控细胞内氧化还原平衡。在本发明的一个实 施方案中，观察到通过在重组微生物中过表达PntAB进一步增加 PntAB活性，增加了 OPS产 量（表17)。
[0033] 此外，本发明重组微生物的特征在于0-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排透性酶 (YfiK)、高丝氨酸/高丝氨酸内酯外排蛋白质（RhtB ;EG11469)或苏氨酸/高丝氨酸内酯外 排蛋白质（RhtC ;EG11468)的增加。已知YfiK作为外运蛋白用来向细胞外运输半胱氨酸和 OAS (Franke I 等人，J. Bacteriology, 185:1161-1166, 2003)，据报道 RhtB 作为高丝氨酸 / 高丝氨酸内酯、苏氨酸前体的胞间外运蛋白。此外，已知RhtC为苏氨酸和高丝氨酸的外运 蛋白。YfiK、RhtC和RhtB活性的增加表明了 OPS积累菌株生长和OPS产量的增加（表18)。 [0034] 可使用各种公知的方法，包括但不限于增加编码目的酶的基因拷贝数、向基因调 控区引入突变以增加酶活性、用突变基因取代染色体基因以增加酶活性，以及向染色体基 因引入突变以增加酶活性，从而实现酶活性的增加。
[0035] 此外，本发明的重组微生物进一步的特征在于，磷酸甘油酸变位酶活性的降低。 磷酸甘油酸变位酶存在三种形式的同工酶：GpmI、GpmA和GpmB，其在糖酵解方法中用于将 3_磷酸甘油酸转化成2-磷酸甘油酸。对于使用3-磷酸甘油酸作为底物，这三种酶与催化 3-磷酸羟基丙酮酸合成的SerA竞争。因此，观察到各个酶活性的降低导致产生大量的OPS 前体3-磷酸甘油酸，从而引起OPS生产水平的增加（表19)。
[0036] 在本发明的重组微生物中，也可减少L-丝氨酸脱水酶I (SdaA ;EC 4. 3. 1. 17)或 2-氨基-3-酮丁酸辅酶A连接酶（Kbl)。因此，该重组微生物的特征在于，即使当它培养于 含低浓度甘氨酸或丝氨酸的培养基中，仍能维持或增加 OPS的产量（表20)。
[0037] 此外，本发明的重组微生物进一步的特征在于，IclR活性的降低。IclR为一 种转录因子，其能够抑制旁路操纵子aceBAK的表达（L Gui等人，J. Bacteriol.，Vol 178, No. 1，321-324, 1996)。当它被缺失后，观察到OPS产量的增加（表21)。
[0038] 同样，本发明的重组微生物进一步的特征在于，选自下组的酶的活性增加：i)乙 酰基-CoA合成酶（Acs)、ii)乙酸激酶（AckA)-磷酸转乙酰酶（Pta)、iii)苹果酸合成酶 G (GlcB)、iv)苹果酸脱氢酶（MaeB)、v)谷氨酸脱氢酶（GdhA)、vi)乙醛酸醛连接酶（Glc)、 vii)羟基丙二酸半醛还原酶2 (GlxR)、viii)甘油酸激酶II (GlxK)和其组合。
[0039] 在本发明具体的实施方案中，当进一步增加 i)Acs (EC No. 6. 2. I. I J Bacteriol. 1995May ; 177 (10) :2878-86)或丙酮酸氧化酶单体（PoxB ;EC L 2. 2. 2)或 ii) AckA和Pta (EC 2, 3, 1，8)，所有这些旨在伴随着生产的NADH的消耗而有效地再利用积累的 醋酸盐，发现本发明的重组微生物中OPS产量的增加（表22)。iii)GlcB(EC No. 2. 3. 3. 9) 和iv)MaeB(EC I. 1. 137)的功能是催化由乙醛酸合成苹果酸和苹果酸向丙酮酸的转化， 其可削弱TCA循环，因此可用于增加葡萄糖的消耗和0-磷酸丝氨酸的产量（表23)。根 据本发明的一个实施方案，催化由2-氧化戊二酸和NADPH合成SerC的底物谷氨酸的 v)GdhA(ECl. 4. 1.2)的增加，赋予了微生物更高的生产OPS的潜能（表17)。已知vi) 61。伍〇4.1.1.47)、￥^)61叉1?伍(：1.1.1.60)和￥1^)61叉1(伍〇2.7.1.31)都将乙醛酸转 化成3-磷酸甘油酸，即增加磷酸甘油酸脱氢酶的底物的水平（Kim HJ等人，J. Bacteri 〇1·，186 (11)，3453-3460, 2004 ;Eva Cusa 等人，J. Bacteriol.，181 (24)，7479-7484, 1999 ; Chnag YY 等人，J. Biol. Chem. 268(6) :3911-3919, 1993)。当进一步增加 Glc、GlxR 和 GlxK 的活性，改善了本发明的重组微生物的糖消耗和生产（表24)。
[0040] 本发明的重组微生物涉及SerB活性降低从而以更高的水平生产OPS的任何微生 物。如果条件满足，任何微生物，无论是原核的或真核的，都落在本发明的范围内。它们中的 典型代表为肠道菌或棒状杆菌。用于本发明的微生物的实例包括埃希氏菌属（Escherichia sp.)、欧文氏菌属（Erwinia sp.)、沙雷氏菌属（Serratia sp.)、普罗维登斯菌属 (Providencia sp·)、棒状杆菌属（Corynebacterium sp.)和短杆菌属（Brevibacterium sp)。优选为埃希氏菌属和棒状杆菌属，更优选为埃希氏菌属，最优选为大肠杆菌。
[0041] 在一个实施方案中，将能生产OPS的重组菌株命名为大肠杆菌CA07-0012,并于 2011年10月12日保藏于位于韩国首尔市西大门区弘济1洞，361-221的韩国微生物保藏 中心（Korean Culture Center of Microorganisms)，保藏号为 KCCM11212P。
[0042] 此外，在一个实施方案中，将能生产OPS的重组菌株命名为大肠杆菌CA07-0022/ pCL-prmf-serA* (G336V) -serC，并于2010年9月28日保藏于位于韩国首尔西大门 区弘济1洞，361-221的韩国微生物保藏中心，保藏号为KCCM11103P。本申请中， 术语"CA07-0022/pCL-prmf-serA*(G336V)-serC" 可与 CA07_0022serA*(G336V)/ p