重组微生物为保藏号为KCCM11103P或KCCM11212P 的保藏微生物。更优选地，生产OPS的重组微生物为保藏号为KCCM11103P的微生物。
[0065] 发明实施方式
[0066] 通过下述实施例可更好地了解本发明，所述实施例用于说明而非旨在限制本发 明。
[0067] 〈制备生产0-磷酸丝氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium)和使用该棒状杆菌生产 0-磷酸丝氨酸〉
[0068] 实施例1:制备磷酸丝氨酸磷酸酶（serB)缺失的棒状杆菌菌株
[0069] 通过使编码催化由0-磷酸丝氨酸合成L-丝氨酸的磷酸丝氨酸磷酸酶的serB基 因 （SEQ ID NO: 13, EC 3. 1.3. 3)从谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum) 13032 上发生缺失，从而对其进行修饰。将用于失活serB的片段构建到这个末端。为此，设计用于 制备本发明的重组菌株13032-Λ serB的引物。首先，根据NIH GenBank的数据，获得谷氨 酸棒状杆菌13032的serB序列，并且基于该serB序列合成SEQ ID N0S: 22~27所示的引 物。为了进行位点特异性基因中断（gene disruption)，使用不能在谷氨酸棒状杆菌中复制 的pDC载体。构建其中serB的开放阅读框被内部受到破坏的pDC-Δ serB质粒，用于在谷 氨酸棒状杆菌的突变菌株中制备位点特异性serB基因缺失。通过使用SEQ ID N0S:22和 23以及SEQ ID N0S:24和25的引物对，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模 板，进行交叉PCR，并将PCR产物导入到pDC载体中，产生pDC- Λ serB的内部基因中断。通 过电穿孔，将产生的重组质粒转化到野生型谷氨酸棒状杆菌中van der Rest等人，1999)。 通过初级重组（交换），再进行二级重组（交换）将质粒导入到染色体，以从染色体中切除 原始serB。
[0070] 完成二级重组后，用SEQ ID N0S:26和27所示的一对基因特异性引物进行诊断 PCR，分析含有serB缺失突变的谷氨酸棒状杆菌转化子。将重组菌命名为CB01-0047。
[0071] 实施例2:磷酸丝氨酸磷酸酶缺失型棒状杆菌菌株的0-磷酸丝氨酸生产率试验
[0072] 将谷氨酸棒状杆菌13032发生serB缺失而产生的预期积累0-磷酸丝氨酸的突 变菌株CB01-0047涂布于BHIS平板，并在30°C培养箱中培养过夜。此后，用铂环将出现在 BHIS平板上的菌落接种到如表1所示25mL的滴度培养基（titer medium)中，然后于30°C、 200rpm振荡培养48小时。结果概述与下表2中。
[0073] 表 1
【主权项】
1. 生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括： 1) 培养其中内源磷酸丝氨酸磷酸酶（SerB)活性降低的重组微生物，以生产O-磷酸丝 氨酸（OPS);以及 2) 在0-磷酸丝氨酸巯解酶（OPSS)或表达OPSS的微生物存在下，使步骤1)的OPS和 硫化物进行反应，以生产半胱氨酸或其衍生物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述磷酸丝氨酸磷酸酶具有SEQ ID NO: 1或2所 示的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中通过选自下组的方法降低酶活性：缺失编码该酶 的染色体基因、向染色体基因中引入突变以降低内源基因活性、用突变基因取代染色体基 因以降低内源酶活性、向基因的调控区引入突变以降低内源基因活性，以及引入与基因转 录本互补的反义寡核苷酸以抑制mRNA的翻译。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中内源SerB活性被降低的重组微生物培养于含有甘 氨酸或丝氨酸的培养基中。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中培养基所含的甘氨酸的量为0. 1~10g/L。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中培养基中所含的丝氨酸的量为0. 1~5g/L。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加磷酸甘油 酸脱氢酶（SerA)或磷酸丝氨酸氨基转移酶（SerC)的活性。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中SerA为野生型或抗丝氨酸反馈抑制的突变体。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中： i) SerA具有选自SEQ ID NOS: 3~7的一种氨基酸序列；以及 ii) SerC具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低 PhnCDE (phnC (磷酸酯转运蛋白EG 10713的ATP结合组分）-phnD (Pn转运蛋白EG 10714的 周质结合组分）-PhnE (烷基磷酸酯ABC转运蛋白EG 11283的整体膜组分））。
11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低碱性磷酸 酶（PhoA)或酸性磷酸酶（AphA)的活性。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加核苷酸转 氢酶（PntAB)的活性。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加失少一种 选自下组酶的活性：〇-乙酰基丝氨酸/半胱氨酸外排透性酶（YfiK)、高丝氨酸/高丝氨酸 内酯外排蛋白（RhtB)，以及苏氨酸/高丝氨酸外排蛋白（RhtC)。
14. 根据权利要求7、12或13所述的方法，其中通过选自下述的方法增加酶活性水平： 增加编码酶的基因的拷贝数、向基因调控区引入突变以增加酶活性、用突变基因取代染色 体基因以增加酶活性，以及向染色体基因引入突变以增加酶活性。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低至少一种 选自下组的酶的活性：磷酸甘油酸变位酶同工酶（GpmA、GpmI或GpmB)。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低L-丝氨酸 脱水酶I (SdaA)的活性。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以降低2-氨 基-3-酮丁酸辅酶A连接酶（Kbl)或转录因子（IclR)的活性。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物被进一步改性，以增加至少一 种选自下组的酶的活性：乙酰基-CoA合成酶（Acs)、乙酸激酶（AckA)-磷酸转乙酰基酶 (Pta)、苹果酸合成酶G(GlcB)、苹果酸脱氢酶（MaeB)、谷氨酸脱氢酶（GdhA)、乙醛酸醛连接 酶（Glc)、羟丙二酸半醛还原酶2 (GlxR)和甘油酸激酶II (GlxK)。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述重组微生物通过增加至少一种选自下组的 酶的活性而在糖消耗和生长方面得到改善：Glc、GlxR以及GlxK。
20. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物为埃希氏菌属（Escherichia sp.)或棒状杆菌（Coryneform bacteria)。
21. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)的硫化物选自下组：Na 2S、NaSH、（NH4) 2S、 H2S、Na2S2O 3和其组合。
22. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中使用的硫化物的摩尔浓度为酶转化中 所用OPS的0. 1~3倍。
23. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)的OPSS源自至少一种选自下述的菌种： 超嗜热古菌（Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis)、耻垢分 枝杆菌（Mycobacterium smegmatis)和阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis) 〇
24. 根据权利要求23所述的方法，其中OPSS被进一步改性，以增加步骤2)的转化率。
25. 根据权利要求1所述的方法，其中在选自0. 001~2mM PLP (吡哆醛-5-磷酸酯）、 0. 001~IOOmM DTT (二硫苏糖醇）和其组合的辅助因子的存在下，进行步骤2)的转化。
26. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括纯化分离和纯化半胱氨酸或其衍生物。
27. 重组微生物，其内源SerB的活性被降低。
28. 根据权利要求27所述的重组微生物，其被进一步改性，以增加SerA或SerC的活 性，其中所述SerA抗丝氨酸的反馈抑制。
29. 根据权利要求27所述的重组微生物，其被进一步改性，以降低Phn⑶E、PhoA和 AphA中至少一种的活性。
30. 根据权利要求27所述的重组微生物，其保藏号为KCCM11103P。
【专利摘要】本发明涉及用O-磷酸丝氨酸作为中间体生产半胱氨酸或其衍生物的方法以及用于生产O-磷酸丝氨酸的重组微生物。KCCM11103P20100928KCCM11212P20111012
【IPC分类】C12N1-21, C12R1-15, C12P13-12
【公开号】CN104862352
【申请号】CN201510065315
【发明人】申秀安, 严惠媛, 张真淑, 裵贤爱, 全成后, 赵宰贤, 宋秉哲, 李京珉, 梁殷彬, 申容旭, 金蕙园, 金率
【申请人】Cj第一制糖株式会社
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2011年10月18日
【公告号】CN102906272A, US8557549, US20120190081, US20120190082, US20120190083