CL-prmf-serA* (G336V) -serC 互换使用。
[0043] 菌株在IL发酵罐中培养80小时后，以19. 5g/L的浓度生产0-磷酸丝氨酸（实施 例 35)。
[0044] 如本申请中所使用的，术语"培养"是指在人工控制的条件下生产微生物。可使用 本领域公知的合适培养基和培养条件实施培养过程。本领域技术人员可易于控制与所使用 的菌株相应的培养过程。例如，可以分批型、连续型、补料分批型实施，但不限于此。
[0045] 此外，培养基含有碳源。碳源的实例包括糖类和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、 果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，油类和脂肪如豆油、葵花油、蓖麻油和椰油，脂肪酸如棕榈酸、 硬脂酸和亚油酸，醇类如甘油和乙醇，以及有机酸如乙酸。这些碳源可单独存在或组合存在 于培养基中。该培养基可含有作为氮源的有机物如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、 玉米浆、大豆和面粉蛋白，或无机氮化合物如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸 铵。这些氮源可单独使用或组合使用。培养基可含有磷酸二氢钾、磷酸钾或相应的钠盐作 为磷源。培养基可含有金属盐如硫酸镁或硫酸铁。培养基还可含有氨基酸、微生物和适合 的前体物。营养元素可以分批的方式或连续的方式添加到培养基中。
[0046] 在培养过程中，可以适宜的方式向培养基加入化合物如氢氧化按、氢氧化钾、氨、 磷酸和硫酸，以调节培养基的PH值。此外，在培养过程中，可用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯 抑制泡沫的形成。此外，为维持培养基中的富氧环境，可将氧气或含氧的气体注入到培养基 中。为维持厌氧或微氧环境，在不通气的条件下提供氮气、氢气或二氧化碳。通常，可将培 养基维持在27°C~37°C，优选维持在30°C~35°C。可将培养期维持到获得所需量的目标 产物，优选范围为10~100小时。
[0047] 为了进一步在培养过程中从培养基中收集和回收0PS，可根据培养类型，即分批、 连续或分批补料培养，选择本领域公知的适宜方法。
[0048] 在本发明的方法中，步骤2)致力于在0-磷酸丝氨酸巯解酶（OPSS)或表达OPSS 的微生物存在下，使步骤1)的OPS和硫化物反应，以诱导将0-磷酸丝氨酸转化成半胱氨酸 或其衍生物。
[0049] 由于pH、压强和/或溶解度的差异，可以液态或气态以及本领域通常所用的固态 形式提供硫化物。只要它能转化成硫醇基（SH)，任何硫化物如硫化物（S勹或硫代硫酸盐 (S 2O32I可用于本发明中M尤选地，可为OPS提供硫醇基的Na2S、NaSH、H 2S、（NH4) 2S、NaSH和 Na2S2OjP可使用。在该反应中，一个硫醇基提供给一个OPS分子，以生产一分子的半胱氨酸 或其衍生物。在这个酶转化中，优选以所使用OPS摩尔浓度的0. 1~3倍，更优选以1~2 倍的摩尔浓度添加硫化物。鉴于经济性，提供硫醇基的硫化物和OPS最优选以摩尔比1:1 使用。在本发明的一个实施方案中，使用Na 2S作为硫源。Na2S以在该转化反应中使用的 OPS摩尔浓度的1~3倍进行添加。优选地，以OPS两倍的摩尔浓度进行添加，从而有效地 将OPS转化成半胱氨酸（表34)。
[0050] 如本申请中所使用的，术语"0-磷酸丝氨酸巯解酶（OPSS) "是指催化硫醇基（SH) 向0PS(0-磷酸丝氨酸）转移从而将OPS转化成半胱氨酸的酶。该酶首次发现于超嗜热 古菌（Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis)和阴道毛滴虫 (Trichomonas vaginalis)中（Mino K 和 Ishikawa K，FEBS letters,551:133_138,2003; Burns KE 等人，J. Am. Chem. Soc.，127:11602-11603, 2005) 〇
[0051] 如本申请中所使用的，术语"突变体"是指表现出可遗传或不可遗传的表型改变的 培养物或个体。当和OPSS -起使用时，术语"突变体"倾向于指遗传上发生改变的OPSS酶， 其与野生型相比有效地增加了活性。
[0052] 在本发明中，可通过缺失、取代或添加一部分编码OPSS核苷酸序列构建OPSS突 变。根据本发明的一个实施方案，优选通过缺失耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis) OPSS酶C末端的五个氨基酸残基而制备活性提高的OPSS酶。
[0053] 可在广泛用于酶表达的大肠杆菌中获得OPSS突变体，使用基于密码子优化的基 因合成方法，从而高产率地获得目标酶。或者，可使用基于大量微生物遗传信息的生物信息 学有用酶来源的筛选方法获得OPSS突变体。在本发明的一个实施方案中，通过在各种微生 物中筛选氨基酸的同源序列，选择利用OPS为底物合成半胱氨酸的OPSS酶。在这点上，将 使用通过本领域合适培养基和培养条件获得的细胞团进行裂解，接着纯化含有酶的上清生 产OPSS酶（表26)。
[0054] 此外，开发了经济地获得OPSS酶的高产率表达系统。使用T7启动子的pET载体是 本领域公知的。然而，本发明的发明人开发了一种名为CJl系统（韩国专利10-0620092B1) 的酶表达系统，替代常规的系统。在本发明的一个实施方案中，在相同条件下将含有T7启 动子的PET系统和含有CJl启动子的CJl系统的OPSS表达水平进行比较。结果，CJl系 统表现出比PET系统更高的OPSS表达水平。此外，在pET系统中OPSS的过表达需要低温 (18°C )和长时间，但在pCL-pCJl系统中需要高温（37°C )和短时间。优选地，使用pCL-pCJl 系统用于获得OPSS (实施例46)。
[0055] 可使用各种本领域公知的方法实现酶活性的增加。例如，可通过增加编码OPSS基 因的拷贝数、使用强启动子或引入基因突变来实现。
[0056] 可使用各种本领域公知的方法实现OPSS酶转化的优化。例如，该优化可基于充分 了解OPSS的特性，如最佳的温度和pH、对底物的抑制、底物浓度、热稳定性等。此外，可通过 酶转化的最佳条件来确定优化，如最佳OPSS浓度、依据浓度使用的底物的最佳平衡、为酶 转化提供SH的优选硫化物、优选的特定缓冲剂、产生的离子的影响和辅因子以及它们的最 佳浓度。
[0057] 在本发明的一个实施方案中，将使用上述方法获得的OPSS酶特征化，并且基于确 定的特征，开发了经济上有益、具有将OPS向半胱氨酸转化的高转化率并保证酶稳定性的 酶转化方法。在该酶转化方法中，反应温度可设置在37°C~80°C，具体地，古细菌（Archea) 的Ape-OPSS (SEQ ID NO: 12)在60°C的酶活性比37°C的高，并且该酶本身对热的稳定性高， 最佳反应性在60°C。另一方面，Msm-T(SEQ ID N0:10)的最佳活性在37°C，并且在60°C热 处理时，活性解除。观察到OPSS酶在6. 0~10. 0的pH范围内具有酶活性。Ape-OPSS在 PH7. 4时具有最佳活性。由于Msm-T在8. 0~9. 0的pH范围内具有最佳活性，因此其与 Ape-OPSS相比在更宽的pH范围内表现出稳定性（表28和31，以及图2和3)。
[0058] 作为辅助因子的0.001-2mM PLP(吡哆醛-5'-磷酸酯）或O.OOl-lOOmM DTT可用 于酶转化中。在本发明的一个实施方案中，在25mM DTT或0.2mM PLP存在下，半胱氨酸转 化率提高了 2. 3倍。同样地，用DTT或PLP处理提高了步骤2)的半胱氨酸转化率。考虑生 产成本的增加和转化率的增加，将辅助因子的添加设置在合理的水平（表30)。
[0059] OPSS的反应条件可根据所使用的OPSS的种类和浓度而改变。在本发明的一个实 施方案中，在各种条件下使用纯OPS(市售获得）、从步骤1)制备的培养物中纯化的OPS以 及步骤1)的含有OPS的培养物，以提供最佳的转化率。结果，半胱氨酸转化率根据OPSS的 种类和浓度、反应温度以及OPS的种类和浓度而变化（图5和6,表35)。
[0060] 本发明的方法可进一步包括分离和纯化步骤2)生产的半胱氨酸。酶转化以后，可 使用本领域公知的方法从培养基中分离和纯化半胱氨酸。
[0061] 本领域技术人员可使用公知的方法通过半胱氨酸化学合成半胱氨酸衍生物。半胱 氨酸可易与乙酰化试剂反应而生产NAC (N-乙酰基半胱氨酸），以及在基本条件下与卤化醋 酸反应而生产SCMC (S-羧甲基半胱氨酸）。这些半胱氨酸衍生物用作治疗咳嗽、支气管炎、 支气管哮喘和咽喉痛药物中的原料。
[0062] 在本发明中，通过微生物发酵获得的OPS液体培养基用作合成半胱氨酸的底物。 通过微生物发酵获得的OPS液体培养基与常规市售获得的纯OPS相比，具有经济上的优势， 因为OPS液体培养基不需要额外的纯化就可以使用，而且转化所需的辅助因子PLP可从发 酵培养物中获得。
[0063] 在本发明的一个实施方案中，开发了一种转化方法，当使用50 μ g/ml Msm-T，在 50mM OPS液体培养基或60mM纯化的OPS培养基、IOOmM Na2S或120mM Na2S和0· 2mM PLP 的条件下，这种转化方法能确保高达80 %的半胱氨酸转化率。本领域技术人员应当理解，可 易于优化并按比例放大使用高活性酶的酶转化。
[0064] 根据其另一个方面，本发明提供用于生产OPS的SerB活性降低的重组微生物。在 一个实施方案中，重组微生物表现出抗丝氨酸反馈的serA或serC的增加或至少一个选自 PhnC/PhnD/PhnE烷基磷酸酯ABC转运蛋白（phnCDE操纵子）、碱性磷酸酶（phoA)和酸性磷 酸酶（aphA)的缺失。优选地，生产OPS的