生产o-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由o-磷酸丝氨酸生产l-半胱氨酸或其衍生物 ...的制作方法
【专利说明】生产ο-磷酸丝氨酸的微生物和使用该微生物由ο-磷酸丝 氨酸生产L-半胱氨酸或其衍生物的方法
[0001] 本申请要求2010年10月20日提交的韩国专利申请No. 10-2010-0102664和2011 年8月26日提交的韩国专利申请No. 10-2011-0086081的优先权；本申请是国际申请日为 2011年10月18日的中国专利申请No. 201180002042. 3的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用0-磷酸丝氨酸作为中间体生产胱氨酸或其衍生物的方法以及用于 生产〇-磷酸丝氨酸的重组微生物。
【背景技术】
[0003] L-半胱氨酸是在所有生物体的硫代谢中起着重要作用的氨基酸。它用于生物合 成蛋白质，如毛发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代谢物以及作为辅酶A的 前体。此外，半胱氨酸的生物合成已知与其它氨基酸的生物合成密切相关，包括L-丝氨酸、 L-甘氨酸和L-蛋氨酸。工业上，发现L-半胱氨酸及其衍生物应用于各种领域，包括制药业 (用于治疗支气管疾病）、化妆品工业（在洗发液中、用于烫发的组合物）和食品工业（抗 氧化剂、增味剂、面团助剂（dough aids)等）。
[0004] L-半胱氨酸曾通过将人头发或动物羽毛进行酸水解工业性地获得（氨基酸 生产的生物技术（Biotechnology of the Amino Acids Production) Ko Aida 编，p 217-223, 1986)。然而，不仅从头发或羽毛获得的半胱氨酸的产量低至7~8%，而且盐酸或 硫酸的使用产生大量的废水，引起环境污染。此外，从头发或羽毛中进行提取可诱发使用者 对其强烈的厌恶感。这些问题导致迫切需要开发环境友好型L-半胱氨酸的生产方法。现 代主要途径包含用微生物发酵。
[0005] 在微生物生产L-半胱氨酸中，代表性的为1)用微生物对D、L-ATC进行生物转 化（Ryu OH, Ju JY 和 Shin CS, Process Biochem. ,32:201-209, 1997)。然而，由于前体 D、L-ATC的低溶解度，这种转化方法在难以工业上应用。2)另一种生产L-半胱氨酸的方 法为用大肠杆菌直接发酵（专利号EP0885962B;Wada M *TakagiH，Appl.Microbiol. Biochem.，73:48-54, 2006)。微生物体内的L-半胱氨酸的过度积累导致细胞内毒性，限制 了 L-半胱氨酸的高浓度生产。为了克服这种缺陷，使用了 L-半胱氨酸-输出蛋白，但在生 产率上也没有显著的改善。
[0006] 至于微生物和植物体内的L-半胱氨酸的生物合成途径，0-乙酰基-丝氨 酸（OAS)作为一种中间前体物，提供L-半胱氨酸的碳骨架（Kredich匪和Tomkins GM，J. Biol. Chem.，241:4955-4965, 1966)。0-乙酰基丝氨酸巯解酶（OASS)，用硫化氢 作为硫供体，催化乙酰基丝氨酸向半胱氨酸的转化。或者，在半胱氨酸的生产中，可 将30 4还原成硫代硫酸盐作为硫供体（Nakamura Τ,Κοη Y，Iwahashi H和Eguchi Y，J. Bacteriol.，156:656-662, 1983)。因此，可用各种硫供体，用微生物积累OAS和OASS生产 半胱氨酸（US6, 579, 705)。通过OAS的半胱氨酸生物合成途径使用两种酶，丝氨酸乙酰转移 酶（CysE)催化丝氨酸向OAS的转化，半胱氨酸合成酶（CysK)催化OAS向半胱氨酸的转化。 这其中，丝氨酸乙酰基转移酶（CysE)对最终产物半胱氨酸的反馈抑制作用高度敏感（Wada M and Takagi H，Appl. Microbiol. Biochem. ,73:48-54, 2006) 〇
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 本发明的发明人通过深入研宄完成本发明，发现在超嗜热古菌（Aeropyrum pernix)、结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis)和阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis)中存在用于合成L-半胱氨酸的0-磷酸丝氨酸疏解酶（OPSS)，其采用 0-磷-L-丝氨酸（OPS)-特异性途径，而非OAS-特异性途径（Mino K和Ishikawa K，FEBS letters, 551:133-138, 2003 ;Burns KE, Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H, McLafferty FW 和 Begley TP, J.Am.Chem.Soc. ,127:11602-11603,2005 ;Westrop GD, Goodall G, Mottram JC and Coombs GH, J. Biol. Chem. , 281:25062-25075, 2006)，以及当结核分 支杆菌的OPSS的5个C-末端氨基酸残基被去除后，即使不存在额外的酶，其也可利 用Na 2S作为硫供体，将OPS转化成半胱氨酸（Argen D，Schnell R和Schneider G，FEBS letters, 583:330-336, 2009)。本发明中，将微生物进行突变，从而在其体内积累0?5，接下 来用OPSS酶进行孵育，从而将OPS转化成半胱氨酸。该方法之前在任何地方都没有公开过。
[0009] 技术方案
[0010] 本发明的一个目的在于提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法。
[0011] 本发明的另一个目的在于提供用于生产〇-磷酸丝氨酸的重组微生物。
[0012] 有益效果
[0013] 本发明的方法通过重组微生物高产量地生产0-磷酸丝氨酸并将其转化成半胱氨 酸，事实上，这更加环保，并且确保比化学合成方法更高效地生产半胱氨酸。本发明通过发 酵和生物转化而生产的半胱氨酸及其衍生物可广泛应用于生产动物和人类食品和食品添 加剂。
【附图说明】
[0014] 图1为通过微生物发酵积累ο-磷酸丝氨酸和积累的ο-磷酸丝氨酸酶转化成L-半 胱氨酸的示意图。
[0015] 图2所示为根据温度的OPS巯解酶的活性。
[0016] 图3为一组表示OPS巯解酶pH敏感性的图表。
[0017] 图4所示为通过SDS-PAGE分析的pET系统和pCL-Pcj 1系统中Msm-T表达水平的 照片。
[0018] 图5所示为将纯化的OPS发酵培养液（fermentation broth)转化成半胱氨酸的 OPS巯解酶的酶活性的图。
[0019] 图6所示为将OPS发酵培养液转化成半胱氨酸的OPS巯解酶的酶活性的图。
【具体实施方式】
[0020] 如本申请中所使用的，术语"半胱氨酸转化"是指0-磷酸丝氨酸巯解酶（OPSS)的 催化反应，其引起底物O-磷酸丝氨酸（OPS)转化成产物半胱氨酸，即，它是指将OPS转化成 半胱氨酸的催化反应。
[0021] 如本申请中所使用的，术语"半胱氨酸转化率"是指产物半胱氨酸的量和起始原料 OPS的百分比。在最佳的反应条件下，1摩尔OPS被转化成1摩尔半胱氨酸。例如，如果100 摩尔的OPS被转化成100摩尔的半胱氨酸，那么半胱氨酸转化率为100%。
[0022] 根据其一个方面，本发明提供生产半胱氨酸或其衍生物的方法，其包括：
[0023] 1)培养经过修饰降低了内源磷酸丝氨酸磷酸酶（SerB)活性的重组微生物，以生 产〇-磷酸丝氨酸（OPS);以及2)0-磷酸丝氨酸巯解酶（OPSS)或表达OPSS的微生物存在 下，将步骤1)的OPS和硫化物进行反应，以生产半胱氨酸或其衍生物。
[0024] 该方法中，步骤1)与培养内源磷酸丝氨酸磷酸酶（SerB)活性降低的重组微生物 有关。
[0025] SerB是具有将OPS水解成L-丝氨酸的活性的蛋白质。因此，内源SerB活性降低 的重组微生物的特征在于其积累OPS。SerB可包括但不限于任何表现SerB活性的氨基酸序 列，并且优选可具有SEQ ID N0:1或2所示的氨基酸序列。然而，只要表现出SerB活性，可 使用任意氨基酸序列，优选与SEQ ID NO: 1或2具有90%或以上，更优选96%或以上，还更 优选98%或以上，最优选99%或以上的同源性。降低的SerB活性是指与修饰之前的菌株 相比，SerB活性降低包括SerB的裂解。降低SerB活性的方法是本领域公知的。示例性实 例包括染色体serB的缺失、向染色体serB中引入突变以降低内源SerB活性、向serB的调 控区引入突变以降低内源SerB活性、用突变基因取代染色体serB以降低内源SerB活性， 以及引入与serB转录本互补的反义寡核苷酸以抑制mRNA的反义，但降低SerB活性的方法 不限于此。这些方法可用于降低本发明中其它酶的活性。
[0026] 内源SerB的裂解导致向重组微生物引入丝氨酸营养缺陷型，因而培养基必须添 加甘氨酸或丝氨酸。甘氨酸可以纯甘氨酸、含甘氨酸酵母提取物或蛋白胨的形式提供。甘 氨酸所含的浓度为〇. 1~l〇g/L，优选浓度为0. 5~3g/L。至于丝氨酸，它可以纯丝氨酸、 含丝氨酸酵母提取物或蛋白胨的形式提供。它在培养基中的浓度范围为0. 1~5g/L，优选 0· 1 ~lg/L〇
[0027] 在本发明的一个实施方案中，当其内源SerB活性受到破坏的（disrupted)突变谷 氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum)或大肠杆菌（E. coli)培