(6-巯基己基）-1_苄基-IH-吡唑-3-酰胺的制备 LC-MS m/z :410. 3 [M-HF
[0300] 实施例100 :5-(4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1-苯基-IH-吡唑-3-酰胺的制备 LC-MS m/z:396. I[M-H]_
[0301] 实施例101 :5-(4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1-(4-甲氧基苯基）-lH-吡 唑-3-酰胺的制备 LC-MS m/z: 426. 7 [M-HF
[0302] 实施例102:2-5-(4-氟苯基）-3-((6-巯基己基）氨基甲酰基）-IH-吡唑-1-乙 酸的制备 LC-MS m/z:378. 4[M-H]_
[0303] 实施例103 :2-5-(4-氟苯基）-3-((6-巯基己基）氨基甲酰基）-IH-吡唑-1-丙 酸的制备LC-MSm/z: 392. 7 [M-HF
[0304] 实施例104 :2-5-(4-氟苯基）-3-((6-巯基己基）氨基甲酰基）-IH-吡唑-1-丁 酸的制备LC-MSm/z:406. 5 [M-HF
[0305] 实施例105 :5-((6-巯基己基）氨基甲酰基）-3-(4-氟苯基）-IH-吡唑-1-甲酸 的制备LC-MSm/z: 364. 8 [M-HF
[0306] 实施例106 :S_ (6- (1-乙酰基-5- (4-氟苯基）-IH-吡唑-3-酰胺基）己基）硫醇 的制备LC-MSm/z: 362. 2 [M-HF
[0307] 实施例107 :3_ (4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1_乙基-IH-吡唑-5-酰胺的制备 LC-MSm/z: 348. 6 [M-HF
[0308] 实施例108 :3_ (4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1_正丙基-IH-吡唑-5-酰胺的制 备LC-MSm/z: 362. 3 [M-HF
[0309] 实施例109 :3_ (4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1_异丙基-IH-吡唑-5-酰胺的制 备LC-MSm/z: 362. 5 [M-HF
[0310] 实施例110 :3_ (4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1-正丁基-IH-吡唑-5-酰胺的制 备LC-MSm/z:376. 7[M-H]-
[0311] 实施例111 :3_(4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1-异丁基-IH-吡唑-5-酰胺的制 备LC-MSm/z:376. 2[M-H]-
[0312] 实施例112 :3-(4-氟苯基）-N_(6-巯基己基）-1_叔丁基-IH-吡唑-5-酰胺的制 备LC-MSm/z:376. 0[M-H]-
[0313] 实施例113 :3-(4-氟苯基）-N_(6-巯基己基）-1_苄基-IH-吡唑-5-酰胺的制备 LC-MSm/z:410. 5 [M-HF
[0314] 实施例114:2-3-(4-氟苯基）-5-((6-巯基己基）氨基甲酰基）-IH-吡唑-1-乙 酸：的制备LC-MSm/z:378. 1[M-H]_
[0315] 实施例115 :2-3-(4-氟苯基）-5-((6-巯基己基）氨基甲酰基）-lH_吡唑-1-丙 酸的制备LC-MSm/z: 392. 3 [M-HF
[0316] 实施例116 :2-3-(4-氟苯基）-5-((6-巯基己基）氨基甲酰基）-IH-吡唑-1-丁 酸的制备LC-MSm/z:406.6[M-Hr
[0317] 实施例117 :3-((6-巯基己基）氨基甲酰基）-5-(4-氟苯基）-IH-吡唑-1-甲酸 的制备LC-MSm/z: 364. 7 [M-HF
[0318] 实施例118 :S_ (6-(1-乙酰基-3-(4-氟苯基）-IH-吡唑-5-酰胺基）己基）硫醇 的制备LC-MSm/z: 362. 5 [M-HF
[0319] 实施例119 :3_ (4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1_甲基-IH-吡唑-5-酰胺的制备 LC-MSm/z:334.I[M-H]_
[0320] 实施例120 :3-(4-氟苯基）-N_(6-巯基己基）-1，4_二甲基-IH-吡唑-5-酰胺的 制备LC-MSm/z: 346. 6 [M-HF
[0321] 实施例121 :3_ (4-氟苯基）-N-(6-巯基己基）-1_羟基正丙基-4-甲基-IH-吡 唑-5-酰胺的制备LC-MSm/z: 392. 3 [M-HF
[0322] 实施例122 :5_ (4-氟苯基）-1-(2-羟乙基）-N-(6-巯基己基）-IH-吡唑-3-酰胺 的制备
[0324] 将4. 49g (IOmmol) 2-3- ((6-(乙酰硫基）己基）氨基甲酰基）-5- (4-氟苯 基）-IH-吡唑-1-乙酸乙酯溶于IOOmL干燥的四氢呋喃，加入0. 76g (20mmol) LiAlH4,室温反 应30min后，加入IOOmL水，50mL乙酸乙醋萃取2次，收集乙酸乙醋层，无水硫酸钠干燥。浓 缩后粗品经柱层析纯化（硅胶，石油醚/乙酸乙酯，10/1)得油状物2. 78g，收率为76. 3%。 LC-MS m/z:364. 6[M-H]_
[0325] 按照实施例122的制备方法，选择适当的原料，制得实施例123-实施例127的化 合物。
[0326] 实施例123 :5_ (4-氟苯基）-1-(3-羟丙基）-N-(6-巯基己基）-IH-吡唑-3-酰胺 的制备 LC-MS m/z:378. 8[M-H]_
[0327] 实施例124 :5-(4-氟苯基）-1-(4-羟丁基）-N-(6-巯基己基）-IH-吡唑-3-酰胺 的制备 LC-MS m/z: 391. 9 [M-HF
[0328] 实施例125 :3_ (4-氟苯基）-1-(2-羟乙基）-N-(6-巯基己基）-IH-吡唑-5-酰胺 的制备 LC-MS m/z: 364. 2 [M-HF
[0329] 实施例126 :3_ (4-氟苯基）-1-(3-羟丙基）-N-(6-巯基己基）-IH-吡唑-5-酰胺 的制备 LC-MS m/z:377. 9[M-H]_
[0330] 实施例127 :3- (4-氟苯基）-1- (4-羟丁基）-N- (6-巯基己基）-IH-吡唑-5-酰胺 的制备 LC-MS m/z: 392. 2 [M-HF
[0331] 实施例128.本发明产物药理作用研宄
[0332] 实验设空白对照组（不加药）和阳性对照组（伏立诺他）。室温下将待测化合物 和他1&核提取物（50叩）预培养151^11，加入荧光底物8〇(3-1^8仏(3)-41?：。371：下培养 60min后，加入25 y L终止剂（含Trypsin和SAHA)终止反应。15min后，应用全波长多功 能酶标仪在激发和发射波长分别为355nm和460nm时检测荧光强度，计算抑制率。目标化 合物对HDACS酶抑制活性见Tab. 1。
[0333] Tab. I HDAC6 inhibitory activities for SAHA, tubacin and target compounds①
[0334]
[0336]①The reaction buffer (pH = 8. 0) contains 25mmol ? L_1Tris/HCl, 137mmol ? L-1 NaCl, 2. 7mmol ?L 1KCl, lmmol ?L 1MgCl2, 0.1 mg ?mL 1BSA and 2OmmoI ?L 1BPS. All reactions were performed in black half area 96-well microplates.
[0337] ②SAHA was considered as positive control medicine, and Tubacin was tool medicine.
[0338] 抗细胞增殖的体外抑制活性试验
[0339] 1.细胞复苏
[0340] 从液氮中小心取出细胞（冻存管）在37~40°C水浴中迅速全部融化，使细胞迅 速越过极易受损的0~5°C温度范围。在无菌条件下用移液枪吸出细胞放入离心管中，在 1300r/min下离心3min，轻轻弃去上清液后加入培养液，吹打混匀细胞，移入培养瓶中放入 二氧化碳培养箱中培养，4h后换液一次。
[0341] 2?细胞传代
[0342] 细胞复苏后需培养传代2-3次待其稳定后方可进行实验，每次传代以细胞贴满培 养瓶底部90 %为准。
[0343] 3?细胞埋板
[0344] 细胞生长贴满培养瓶底部时用胰蛋白酶溶液（0. 25% )使其从培养瓶底部消化下 来。轻轻弃去上胰蛋白酶溶液后加入IOmL培养液，吹打混匀细胞，吸取IOuL细胞混悬液加 入细胞计数板中计数，调整细胞浓度为3. 5X IO4个/孔。96孔板中除Al孔为空白孔不加 细胞外，其余皆加入IOOuL细胞混悬液。将96孔板放入培养箱中培养24h。
[0345] 4?细胞加药
[0346] 先用50 y L DMSO溶解药物。而后加入适量培养液，使药物溶解成2mmol/mL药液。 然后在96孔板中将药物溶解成100, 50, 25, 12. 5, 6. 25 y mol/mL。每个浓度加入3孔，其中 周围两行两列细胞长势受环境影响较大，只作为空白细胞孔使用。将96孔板放入培养箱中 培养24h。
[0347] MTT试验测定方法
[0348] 将细胞按I. 5~3X IO4细胞密度埋96孔板，每孔100uL，细胞贴壁24h加入不同浓 度的药物（IOOuL/孔），药物与细胞孵育96h后加入MTT，放入培养箱中4h后，弃去MTT(四 氮唑）溶液，加入DMSO 200uL。在磁力振荡器上振荡使存活细胞与MTT反应产物甲臜充分 溶解，放入酶标仪中在570nm波长处读出OD值。按下式计算抑制率：
[0349]
[0350] Trypan blue试验测定方法
[0351] 化合物对肿瘤细胞的生长抑制作用采用细胞计数法考察。将一定密度（4XIO4个 /mL)的细胞悬液接种于24孔培养板，2mL/孔，加入不同浓度药物共同孵育72小时后于显 微镜下计数，根据以下公式求得细胞生长抑制率，并求得半数生长抑制浓度IG 5tl (使细胞生 长抑制率达50%时的药物浓度）。按下式计算抑制率：
[0352]
[0353] 以SAHA为阳性对照药，目标化合物的抗细胞增殖的体外抑制活性试验。试验结果 见 Tab. 2。
[0354] Tab. 2 Antiproliferative activities on MCF-7 and HL-60 cell lines were evaluated by using MTT and Trypan blue assays respectively for Vorinostat and target compounds.
[0355]
[0356] Vorinostat was considered as positive control medicine.
[0357] IC50Value is the concentration that reduces 50%of cell viability comparing with the untreated cells.
[0358] IG50Value is the concentration that inhibits 50%of cell growth comparing with the untreated cells.
[0359] 上述试验结果表明，本发明要保护的通式的化合物具有良好的抗肿瘤活性和HDAC 抑制作用。本发明的化合物具有很好的工业应用前景。
【主权项】
1. 如通式I所示的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物： 其中，环A为啦挫环； 札独立选自一个或多个如下取代基：卤素、（(：「(；）烷基、卤代（Q-C；)烷基、二氧亚甲 基、（C「C4)烷氧基、C6-C1(I芳基、硝基、卤代（C「C4)烷氧基；优选卤素； 馬独立选自H或（CfC5)烷基，优选为H; 馬独立选自H、（Ci-C；)烷基、（Q-C；)羟基烷基、（C2-C4)酰基、（C2-C4)烷氧羰基、C6-C1Q 芳基、（CfC4)烷基取代苯基、（CfC4)烷氧基取代苯基或苄基；优选为H; &独立选自H、（(：「(；）烷基、（Q-Q)羟基烷基、（C2-C4)酰基、（C2-C4)烷氧羰基、C6-C1Q 芳基、（CfC4)烷基取代苯基、（CfC4)烷氧基取代苯基或苄基；优选为H; 馬与1?4不同时存在；m为1-5之间的整数； n为0-4之间的整数； m+n为小于8的整数； X为〇12或.r5Sh或乙酰基。2. 根据权利要求1所述的通式I的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物： 其中， n= 0 ; X为ch2〇3. 根据权利要求1所述的通式I的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：其中， m为2-4之间的整数； n为2-3之间的整数； 遺4. 根据权利要求1或2所述的通式I的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物：其 中， R$F R#H; R#H; R4 为H;n= 0 ; X为亚甲基。5. 根据权利要求1或3所述的通式I的化合物、及其药学上可接受的盐或水合物： 其中， R$F R#H; R#H; R4 为H; m为2-4之间的