检测肿瘤乏氧的化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于荧光探针领域。具体而言，本发明涉及以1，8-萘酰亚胺偶氮苯为母体 用于肿瘤乏氧检测的荧光探针及其制备和检测方法。
【背景技术】
[0002] 荧光分子成像是光学成像中最具有发展前景、研究最热、最主要的一个方向之一。 它主要是利用荧光分子探针对活体内靶细胞或靶标分子进行特异性标记，在外界光源的激 发下被标记的靶标部位发出荧光信号，通过系列图像后处理技术，将活体组织在分子和细 胞水平上的生物学过程动态、实时示踪。而将分子之间的相互作用通过荧光信号传导出来 的分子(包括小分子、聚合物和纳米颗粒）被称为荧光分子探针或荧光分子传感器。作为一 种灵敏度高、选择性好、检测方便、检出限低的微量分析技术，近几十年来，荧光分子探针技 术得以迅速发展，并广泛应用于各个领域。
[0003] 乏氧是所有实体瘤的内在特征，绝大多数的实体瘤氧分压低于其他正常组织。当 肿瘤较小时，乏氧现象不是很明显，但是当肿瘤细胞不断扩散时，乏氧和局部缺血就成为导 致一些重大疾病的重要因素。乏氧癌细胞具有侵犯性和转移性，预测起来较为困难，并且对 传统的放疗、化疗和传统的免疫疗法都有抵制性，因此普及对乏氧肿瘤的理解及研究合理 实用的检测方法变得尤为重要。同时对乏氧的检测为疾病的早期诊断(特别是实体肿瘤)提 供了条件。已报道的乏氧探针可以大致分为两类：一是针对乏氧特殊化学环境的，如较低的 PH值、较低的氧分压和较强的还原性
[0004] (Bioconjugate Chem. , 2012, 23:324-329;Bioorg. Med. Chem.，2008, 16:3255-3260 );二是通过检测乏氧条件下过表达的酶来间接检测细 胞乏氧，如硝基还原酶和碳酐酶等（〇1^311；[01^1^618,2011，13:928-931;016111. Commun.，2011，47:8301-8303)。这些荧光探针都可以一定程度的区分乏氧细胞和正常细 胞，但同时存在乏氧/有氧荧光变化倍数不大、探针合成较复杂等问题。2010年，Nagano 等人报道了一种新型的乏氧探针（J. Am. Chem. Soc. ,2010, 132(45) :15846-15848),他们将 Cy5. 5与BHQ3通过Linker连接在一起，在乏氧条件下，BHQ3的偶氮键被还原断裂，使淬灭 基结构破坏，荧光释放出来。
[0005] 在本发明中，我们基于偶氮键在乏氧条件下可以被还原机理，设计合成了一系列 以萘酰亚胺偶氮苯为母体的荧光探针，之后又以该荧光探针作为淬灭基通过FRET作用淬 灭其他荧光团。该方法合成简便，可以实现荧光〇ff-〇n检测，对肿瘤乏氧有较好的检测效 果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于合成一系列新型的乏氧探针，可以通过荧光变化实现对肿瘤乏 氧的检测，其设计理念如图1所示。
[0007] 本发明中探针的母体结构为1，8-萘酰亚胺，4位通过共价键与偶氮苯或其衍生物 相连。反应机理为偶氮键在乏氧条件下被还原成氨基，荧光释放出来。
[0008] 本发明中的探针可以包含一种荧光团，也可以包含双荧光团，通过FRET (fluorescenceresonanceenergytransfer,突光共振能量转移）作用实现突光的增强。
[0009] 本发明中的荧光探针结构如下式I所示：
[0010]
[0011] 式中，
[0012] R1 选自-NR3R4;
[0013] R3 选自 _ (CH2)mR6 或-(CH2)nR5 ;
[0014]R4 选自-(CH2)mR6 ;
[0015] R5 和R6 各自独立选自-CH3、-OH、-Br、-Cl、-CECH、-N3 ;
[0016] R2 选自-(CH2)pCH3、- (CH2)PCH2-、- (CH2O)qCH3、- (CH2O)qCH2-、- (CH2O)rH、- (CH2O) r-、-CH2 (CH2OCH2)sCH20H、-CH2 (CH2OCH2)sCH2〇-、-CH2 (CH2OCH2)tCH3 和-CH2 (CH2OCH2)tCH2-;
[0017] 其中n、m、p、q、r、s、t=0_18 的整数；
[0018] A不存在，或为苯环；
[0019]B不存在，或为荧光团。
[0020] 在一【具体实施方式】中，B为选自罗丹明B或氟硼吡咯的荧光团。
[0021] 在一个【具体实施方式】中，B选自：
[0022]
[0023] 在一【具体实施方式】中，B不存在。
[0024] 在一【具体实施方式】中，所述R3或R4各自为C1-C4烷基。
[0025] 在一【具体实施方式】中，所述R3和R4各自为甲基或乙基。
[0026] 在一【具体实施方式】中，所述R5和R6各自为-CH3。
[0027] 在一【具体实施方式】中，所述R2 选自 _(CH2)pCH 3、_(CH20)占、或-CH2 (CH20CH2)sCH 20H。
[0028] 在一【具体实施方式】中，所述11、111、口、9、1'、8、七各自为0、1、2、3、4或5。
[0029] 在一【具体实施方式】中，所述A不存在。
[0030] 在一【具体实施方式】中，所述A为苯环。
[0031] 在一具体实施例中，所述化合物选自：
[0032]
[0033] 本发明提供本发明荧光探针的制备方法，包括：
[0034] ( 1)在溶剂和催化剂的存在下，由4-硝基萘酐制备4-氨基萘酐；
[0035] (2)在溶剂的存在下，由4-氨基萘酐及R2-NH2制备得到下式II的化合物：
[0036]
[0037] (3)使式II化合物在盐酸和亚硝酸钠的存在下在冰浴中反应；
[0038] (4)在步骤（3)的反应溶液中加入下式III的化合物在冰浴中进行反应：
[0039]
[0040] (5)撤去步骤（4)的冰浴，以将pH调节至6左右，继续反应，从而制备得到本发明 式I的不含有B的化合物。
[0041] 在一个【具体实施方式】中，所述方法还包括：
[0042] (6)在二氯甲烷、三乙胺和HBTU (苯并三氮唑_N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸盐） 的存在下，使步骤（5)所得产物先在冰浴中、然后在室温下与B反应，从而制备得到含B的 式I化合物。
[0043] 在一个【具体实施方式】中，步骤（1)在无水乙醇、氯化亚锡和浓盐酸的存在下进行。
[0044] 在一个【具体实施方式】中，步骤（2)所用的溶剂为二甲基甲酰胺（DMF)和正丁胺。
[0045] 在一个【具体实施方式】中，步骤（3)中，先将式II化合物加到去离子水和浓盐酸中， 冰浴下搅拌大约30分钟；然后将溶于去离子水的亚硝酸钠加入上述溶液中，冰浴下继续反 应约30分钟。
[0046] 在一个【具体实施方式】中，步骤（4)中，加入式III化合物反应大约30分钟。
[0047] 在一个【具体实施方式】中，步骤（4)结束后撤去冰浴，然后将溶液pH调节到大约6， 继续反应大约60分钟。
[0048] 在一个【具体实施方式】中，通过加入饱和乙酸钠溶液而将pH调节到6左右。
[0049] 在一个【具体实施方式】，步骤（6)中，使步骤（5)所得产物先在冰浴中与B反应大约 60分钟，然后在室温下与B反应大约10小时。
[0050] 在一【具体实施方式】中，用于上述步骤的反应溶剂选自冰醋酸，二甲基甲酰胺，二氯 甲烷，甲苯，乙醇，盐酸，水或其混合溶液。
[0051] 本发明还包括本发明所述的探针分子在肿瘤乏氧检测中的用途。
[0052] 本发明还包括本发明所述的探针分子在制备用于肿瘤乏氧检测的试剂盒中的用 途。
[0053] 本发明还包括一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有权利要求1一5中任一项所 述的化合物，作为荧光探针分子，用于检测肿瘤乏氧状态。
[0054] 在一个具体实施例中，本发明的检测试剂盒还含有使用说明书以及其它的适于检 测肿瘤乏氧状态所需的试剂。
[0055] 本发明还提供一种检测肿瘤乏氧的方法，所述方法包括使本发明所述的探针分子 与细胞接触以使所述探针分子透过细胞膜进入细胞内，比较接触前、后荧光的变化，其中， 荧光增强指示肿瘤乏氧。
【附图说明】
[0056] 图1显示探针分子设计思想。
[0057] 图2显示探针分子Pl的吸收（)和发射光谱（一）（Ex:340nm)。
[0058] 图3显示探针分子Pl的荧光发射光谱（一）及使用盐酸、氯化亚锡还原后的荧光 发射光谱（)(Ex:440nm)〇
[0059] 图