量比为1-30:1 ;优选质量比是1-20:1 ;更优选的质量比为3-10:1。
[0026] 本发明提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为体外核酸递送载体的应用，其方 法和步骤如下：
[0027] (1)细胞毒性评价
[0028] 取对数生长期细胞，胰酶消化后用含血清培养基稀释后以一定密度接种于96孔 培养板中，培养24h后，细胞融合度约达到85-90%，将不同浓度的还原敏感性聚乙烯亚胺衍 生物材料与细胞在不含血清的培养基中共同培养4h后（每孔总体积为100 μ 1)，吸弃旧 培养基，每孔分别加入含0. 5mg/ml的MTT的培养基继续培养4h后，吸弃溶液，加入150 μ I DMSO溶解甲臢结晶，然后用酶标仪测定各孔在570nm处的OD值，以未加聚合物溶液孔的OD 值作为对照，计算各聚合物作用条件下细胞的存活率，每组实验设置3个重复孔。
[0029] (2)体外转染
[0030] 取对数生长期细胞，胰酶消化后用含血清培养基稀释后以一定密度接种于96孔 培养板中，培养24h后，细胞融合度约达到85-90%，开始转染。转染时，吸弃旧培养基，每孔 用PBS洗涤两次后，每孔加入含有基因转染复合颗粒(还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与质 粒DNA的复合物)的无血清培养基50 μ 1 (含质粒DNA约lOOng)，培养箱中培养4h后，加入 含血清培养基125 μ 1，继续培养20h后取出培养板，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，加入I X 细胞裂解液20 μ 1，37°C振摇15min后，取10 μ 1裂解液加入50 μ 1荧光素酶底物，用发光检 测仪测定转染效率。
[0031] (3)体外基因沉默效率
[0032] 取对数生长期的能稳定表达报告基因的细胞，胰酶消化后用含血清培养基稀释后 以一定密度接种于96孔培养板中，培养24h后，细胞融合度约达到85-90%，开始递送siRNA 实施基因沉默。递送siRNA时，吸弃旧培养基，每孔用PBS洗涤两次后，每孔加入含有siRNA 与聚合物复合颗粒(还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与siRNA的复合物）的无血清培养基 50μ 1 (每孔添加 siRNAlOpmol)，培养箱中培养4h后，吸弃旧培养基，加入新鲜含血清培养 基100 μ 1，继续培养20h后取出培养板，吸弃旧培养基，用PBS洗2次，加入I X细胞裂解液 20 μ 1，37°C振摇15min后，取10 μ 1裂解液加入50 μ 1荧光素酶底物，以未添加 siRNA聚合 物复合颗粒的正常细胞作为阳性对照，用发光检测仪测定聚合物材料递送siRNA实施基因 沉默的效率。
[0033] 本发明提供的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物作为体内核酸递送载体的应用，其方 法和步骤如下：
[0034] (1)取5-6周龄的的Balb/c小鼠，将小鼠随机分为3组，每组3只，3组分别尾静 脉注射200 μ 1还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物与70 μ g荧光素酶质粒的复合物溶液、200 μ 1 未修饰PEI母体与70 μ g荧光素酶质粒的复合物溶液、200 μ 1含有70 μ g裸荧光素酶质粒 的生理盐水溶液，注射后24h，将小鼠用异氟烷麻醉，麻醉5min后，向小鼠腹腔注射200 μ 1 荧光素酶底物，IOmin后用小动物活体成像仪观察体内转染效果。
[0035] (2)取5-6周龄的的Balb/c小鼠，在第四乳腺垫处皮下接种小鼠来源的乳腺癌 4T1细胞，待肿瘤体积达到150_3时，将小鼠随机分为4组，每组6只，分别瘤内注射靶向 survivin基因的SiRNAsur与聚合物的复合颗粒、聚合物溶液、裸SiRNAsur溶液、生理盐水， siRNA的给药剂量为450pmol/20g小鼠，给药方式为隔天注射一次，连续给药5次，在给药前 一天开始称量小鼠体重，并测量肿瘤体积，隔天测定一次；于最后一次给药后的第6天处死 小鼠，取肿瘤组织，称量瘤重，分别以监测的肿瘤体积、小鼠体重，和最后的瘤重为指标考察 聚合物材料递送治疗性siRNA的体内抗肿瘤效果。
[0036] 本发明的有益效果是，首先，采用烷基对聚乙烯亚胺进行化学改性可以提高聚乙 烯亚胺的疏水性，改善其亲水亲油平衡值，提高材料与核酸固缩形成的复合粒子的稳定性； 其次，脂肪烃基疏水改性后的聚乙烯亚胺与生物膜的亲和力大大增强，能提高细胞摄取量， 进而提高转染效率；再次，在对小分子量聚乙烯亚胺烷基化疏水修饰聚乙烯亚胺的基础上， 进一步巯基化修饰并实施二硫键交联，交联后聚乙烯亚胺的分子量增大，可以对核酸物质 实施有效固缩或包裹，能大大提高聚合物与核酸颗粒形成的复合颗粒的稳定性，并且分子 内的二硫键具有还原环境响应性，在胞内被谷胱甘肽还原酶降解为几乎无毒性的小分子量 聚乙烯亚胺，可以实现核酸物质的胞内有效释放，快速发挥生物学效应。本发明提供的还原 敏感性聚乙烯亚胺衍生物递送质粒DNA的转染效率和递送siRNA的靶基因沉默效率远远高 于市售lipofectamine2000,毒性大大低于lipofectamine2000,是一种高效低毒的核酸递 送载体，具有较好的应用前景。
[0037] 为了详细说明本发明及其特点，下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说 明。应当指出的是，这些实施例仅用于具体说明本发明而不是作为本发明专利范围的限制。
【附图说明】
[0038] 图1是实施例5的合成路线。
[0039] 图2是实施例1中制备所得的还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（bPEI1800-SS_5)的 1H-NMR 图谱。
[0040] 图3是实施例4中制备所得还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物（1PEI2200-SS-5)的 1H-NMR 图谱。
[0041] 图4是实施例5中制备所得还原敏感性聚乙烯亚胺衍生物 (lPEI2200-C12-5. 28-SS-5)的1H-NMR 图谱。
[0042] 图5是试验例1的细胞毒性柱状图。
[0043] 图6是试验例2的体外基因转染效率柱状图。
[0044] 图7是试验例3的体外基因沉默效率柱状图。
[0045] 图8是试验例4的体内递送质粒DNA的小动物活体成像图。
【具体实施方式】：
[0046] 材料来源：分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺bPEI1800(纯度> 99%，Alfa Aesar 天津化学有限公司）;分子量为5000的聚（2-乙基-2-噁唑啉）PEOZs (Alfa Aesar天津化 学有限公司）；分子量为50000的聚（2-乙基-2-噁唑啉）PEOZs (Alfa Aesar天津化学有 限公司）;1_溴癸烧(纯度彡98%，美国sigma公司）、1_溴十二烧(纯度彡99%，美国sigma公 司）、1 _溴十四烧(纯度彡97%，美国sigma公司）；硫化丙烯(纯度彡96%，美国sigma公司）
[0047] 制备例1 :分子量为2200的直线型PEI (1PEI2200)的制备
[0048] 目前，直线型1PEI2200没有市售产品，因此我们以分子量为5000的聚（2 -乙 基-2 -噁唑啉）PEOZ为前体，采用酸水解法脱去其丙酰基得到分子量为2200的1PEI2200， 制备方法如下：称取分子量为5000的聚（2 -乙基-2 -噁唑啉）PEOZ约3g置于250ml圆 底烧瓶中，加入24% (wt/vo 1)的盐酸溶液120ml，11 (TC油浴回流96h，然后中止反应，待反 应体系冷至室温，布氏漏斗减压抽滤该反应体系，得白色滤饼，将白色滤饼室温风干，即得 1PEI2200。
[0049] 制备例2 :分子量为22000的直线型PEI (1PEI22000)的制备
[0050] 我们以分子量为50000的聚（2 -乙基-2 -噁唑啉）PEOZ为前体，采用酸水解法 脱去其丙酰基得到分子量为22000的1PEI22000,制备方法如下：称取分子量为50000的聚 (2 -乙基-2 -噁唑啉）PEOZ约3g置于250ml圆底烧瓶中，加入24%(wt/vol)的盐酸溶液 120ml，IKTC油浴回流96h，然后中止反应，待反应体系冷至室温，布氏漏斗减压抽滤该反应 体系，得白色滤饼，将白色滤饼室温风干，即得IPE122000。
[0051] 制备例3 :脂肪烃基接枝的低分子量聚乙烯亚胺（bPEI1800-C12-12. 5)的制备
[0052] (1)称取分子量为1800的分枝状聚乙烯亚胺（bPEI1800)lg，溶于100mL二氯甲烷 和甲醇（两者体积比为95:5)的混合溶剂中，在30°C下搅拌溶解；
[0053] (2)称取1-溴十二烷0.7245g溶于50ml的二氯甲烷和甲醇（两者体积比为95:5) 的混合溶剂中，以l〇ml/h的速度滴加至上述聚乙烯亚胺溶液中，在40°C下，避光反应24h ;
[0054] (3)所得混合溶液采用旋转蒸发法旋干溶剂得到淡黄色半固体膏状物，将该半固 体膏状物混悬于6ml蒸馏水中，然后用截留分子量为1000的透析袋先在40%的乙醇溶液中 透析6次，再在去离子水中透析24h，将透析后得到的物质冷冻干燥48h后，制得脂肪烃基接 枝的聚乙烯亚胺（bPEI1800-C 12-12. 5)。