一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物免疫技术领域，更具体地，涉及一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法。
【背景技术】
[0002]人类的很多疾病由病毒引起，免疫法和抗病毒药物是抗病毒治疗的两种方法，其中免疫法是目前控制病毒感染的最有效方法。免疫法包括免疫接种以及利用含抗体的血清进行被动免疫，但疫苗、免疫球蛋白等免疫性制剂是蛋白质，其制备往往需要活体动物，制备过程复杂，且对温度、离子、pH敏感，不易保存。此外，蛋白制剂易于引起过敏反应，部分人群不能使用。由于这些特点，某些新发和高致死性病毒，如埃博拉病毒、HIV病毒等，至今尚缺乏适宜的免疫制剂。因此，开发有效的非蛋白类免疫制剂，是预防和治疗病毒性疾病的主要方向之一。
[0003]分子印迹技术可制备在空间结构和结合位点上与靶分子(模板分子)匹配的人工抗体，这种人工抗体又被称为分子印迹聚合物(molecular imprinting polymers, MIP)。分子印迹聚合物是化学合成的高分子聚合物，通过特定的空间结构和化学键(包括共价键、离子键、氢键等)特异性识别和结合靶分子，其吸附特异性与天然抗体类似，但耐受有机溶剂、离子、酸碱、高温和高压。分子印迹聚合物已应用于天然抗体模拟，模拟酶催化，控缓释药物等诸多领域。
[0004]病毒人工抗体已有少量研宄，大部分工作是利用人工抗体对靶病毒的特异性结合能力，检测革E病毒。如Bolisay等利用聚丙稀胺制备烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus, TMV)的分子印迹水凝胶(Bolisay, L.D., et al.Molecularly imprinted polymersfor tobacco mosaic virus recognit1n.B1materials.2006，27 (22): 4165-4168.)，可特异性识别烟草花叶活病毒，而对死病毒没有识别能力(Bolisay, L.D.，et al.0ptimizat1nof virus imprinting methods to improve selectivity and reduce nonspecificbinding.B1macromolecules.2007，8 (12): 3893-3899.)。Cumbo 等利用表面印迹法合成了可特异性结合花叶病毒(turnip yellow mosaic virus)的分子印迹聚合物，这种分子印迹聚合物在人血清中也展现出很高的吸附能力(Cumbo，A.，et al.A syntheticnanomaterial for virus recognit1n produced by surface imprinting.NatureCommunicat1ns.2013，4:1503.) 0 Sankarakumar等运用乳液聚合法合成了大肠杆菌■菌体fr的人工抗体，显示该人工抗体可以降低■菌体感染祀细菌的能力(Sankarakumar，N.and Y.W.Tong.Preventing viral infect1ns with polymeric virus catchers: a novelnanotechnological approach to ant1-viral therapy.Journal of Materials ChemistryB.2013，I (15):2031-2037.)。但以上工作中，分子印迹聚合物是在有机溶液或含水的有机溶液中制备的，由于病毒是大分子化合物，在有机溶液中易变性，影响其形态结构的完整性，导致结合效果不佳。此外，在有机溶剂中制备的分子印迹聚合物，生物兼容性差，不适合体内使用。目前没有研宄系统分析病毒分子印迹聚合物的毒性和生物兼容性；可制备植物病毒或细菌病毒分子印迹聚合物的方法，是否适合用于制备人类病毒的分子印迹聚合物，目前也尚无相应的报道。
[0005]多巴胺在碱性溶液(pH>8.5)中可进行自聚合，多巴胺自聚合体系为水溶性合成体系，不使用有机溶剂，适合制备蛋白质等生物大分子的人工抗体，但是该体系尚未用于制备病毒MIP，主要的原因有两个:(1)多巴胺自聚合膜的厚度在1nm?50nm之间，而大部分病毒直径大于50nm，直接将病毒与多巴胺自聚合体系混合进行自聚合，印迹效果不佳；(2)多巴胺自聚合反应需要在碱性(pH>8.5)条件下进行，病毒在碱性条件下容易变性，影响印迹效果。因此，以全病毒分子为模板分子制备病毒人工抗体时，需要对多巴胺印迹体系进行改进。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的以上缺陷，本发明提供了一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法，通过对催化剂的选择和对反应条件的优化，使得多巴胺能在环境条件更加温和的情况下与靶病毒进行结合，从而生成具有优良性能的病毒人工抗体。
[0007]为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种抗病毒分子印迹聚合物，其特征在于:
[0008]首先，在过硫酸铵的催化下，将载体材料表面修饰多巴胺纳米膜，形成多巴胺-载体材料复合体；然后，将靶病毒与多巴胺-载体材料复合体相结合，形成病毒-多巴胺-载体材料复合体；最后从所述复合体上将所述靶病毒洗脱，即得到抗病毒分子印迹聚合物；
[0009]抗病毒分子印迹聚合物表面有所述靶病毒洗脱后形成的印迹孔穴，用于特异性结合所述靶病毒，并抑制所述靶病毒增殖以及感染宿主。
[0010]优选地，具体步骤如下:
[0011]步骤一:载体的表面修饰
[0012]向多巴胺缓冲液中加入载体材料，缓慢搅拌使之充分反应后弃掉缓冲液，在此过程中，多巴胺在过硫酸胺的催化下聚合在载体材料表面，得到多巴胺-载体材料复合体；
[0013]所述多巴胺缓冲液的配置方法为，将过硫酸铵与多巴胺以3:2?3:1的摩尔比溶于PH值为7.0?8.5的Tris-HCl缓冲溶液中；
[0014]步骤二:病毒-多巴胺-载体材料复合体的生成
[0015]向多巴胺缓冲液中加入步骤一得到的多巴胺-载体材料复合体和靶病毒，缓慢搅拌使之充分反应后弃掉缓冲液，即得到病毒-多巴胺-载体材料复合体；
[0016]所述靶病毒在缓冲液中的浓度为108pfu/mL?1014pfu/mL ；
[0017]步骤三:洗脱靶病毒
[0018]反复洗涤步骤二得到的病毒-多巴胺-载体材料复合体，使所述靶病毒洗脱，即得到抗病毒分子印迹聚合物；靶病毒从复合体上洗脱后留下的印迹孔穴，可用于特异性结合靶病毒，使得所述的抗病毒分子印迹聚合物具有抗病毒效果；
[0019]其中，所述载体材料为纳米级微球、微米级微球或滤膜，如二氧化硅微球、四氧化三铁纳米微球、硝酸纤维滤膜等；当载体材料为微球时，步骤一和步骤二中可通过离心的方法弃掉缓冲液；当载体材料为滤膜时，步骤一和步骤二中可通过直接取出滤膜的方法弃掉缓冲液。
[0020]作为进一步优选地，过硫酸铵与多巴胺的摩尔比为2:1。
[0021]作为进一步优选地，Tris-HCl缓冲溶液的PH值为7.5。
[0022]作为进一步优选地，所述靶病毒为f2噬菌体、T4噬菌体、流感病毒或手足口病病毒。
[0023]作为进一步优选地，步骤三的具体方法为:先用洗涤液洗涤步骤二得到的病毒-多巴胺-载体材料复合体4次?8次，每次30min?50min，再用三蒸水洗涤4次?8次，每次30min?50min，即得到抗病毒分子印迹聚合物；
[0024]所述洗涤液为，含有质量分数为3 %的醋酸以及摩尔浓度为lmol/L的NaCl的水溶液。
[0025]本发明还提供了一种利用该方法制备的抗病毒分子印迹聚合物。
[0026]本发明还提供了一种再生该抗病毒分子印迹聚合物的方法，其特征在于，将所述抗病毒分子印迹聚合物置于纯水中超声震荡20min?40min，更换纯水并重复4次?8次。
[0027]总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果:
[0028]1、通过将载体材料表面修饰多巴胺，保证了抗病毒分子印迹聚合物的制备效率和特异性；
[0029]2、使用过硫酸铵对抗病毒分子印迹聚合物的制备条件进行优化，使修饰了多巴胺聚合物的载体材料与靶病毒结合的过程，在PH值友好的条件下进行，靶病毒不易变形，保证了抗病毒分子印迹聚合物对靶病毒的特异性识别能力；
[0030]3、用该方法制备的抗病毒分子印迹聚合物重生方法简单，经过多次循环后仍然有着优良的性能，可以降低使用成本，具有较好的经济效益；
[0031]4、该抗病毒分子印迹聚合物可在多种pH值，氯化钠浓度以及比粘度的溶液中依然保持良好的吸附性，适用于多种环境条件；
[0032]5、该抗病毒分子印迹聚合物对红细胞、人胚肝细胞无明显毒性。
【附图说明】
[0033]图1是本发明一种抗病毒分子印迹聚合物(MIP)的制备方法的流程图；
[0034]图2为实施例和对比例中，当催化剂过硫酸铵与多巴胺在不同的摩尔比之下制备的抗病毒分子印迹聚合物(MIP)和空白印迹聚合物(NIP)的吸附容量；
[0035]图3为实施例1、实施例2中制备的抗病毒MIP以及对比例1、对比例2制备的NIP的扫描电镜和透射电镜图；
[0036]图4为实施例1中制备的抗病毒MIP、对比例I中制备的NIP以及硅胶颗粒的傅里叶变换红外光谱；
[0037]图5为实施例1中制备的抗病毒MIP的吸附动力学曲线以及对不同噬菌体的吸附容量特性；
[0038]图6a-图6d分别为实施例1中制备的抗病毒MIP在不同的pH值、NaCl浓度、聚乙二醇浓度