因为抗病毒MIP主要通过印迹孔穴保持对靶病毒有特异性吸附，这种吸附特异性不受干扰物的影响。
[0096]试验例4抗病毒MIP在不同环境条件下的吸附特性
[0097]病毒颗粒在中性条件下能最好地保持形态和活性的稳定性，因此前期实验中的缓冲液PH均为7。但MIP可能在不同pH的环境下使用。为验证pH对抗病毒MIP吸附特性的影响，将1mg实施例1中制备的抗病毒MIP和对比例I中制备的NIP加入含103pfu/mLf2噬菌体的缓冲液中，缓冲液的pH值分别为5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0和8.5，室温下震摇2h，双层琼脂培养法测定上清中病毒含量，并计算吸附量。从图6a可见，抗病毒MIP在pH为6.0?8.0的范围内对f2噬菌体的吸附保持稳定。过高或过低的pH均会影响病毒分子的结构，从而干扰抗病毒MIP对靶病毒的识别和结合能力。
[0098]将1mg上述抗病毒MIP和NIP加入含103pfu/mL f2噬菌体的缓冲液中，缓冲液还分别含有不同浓度的氯化钠，室温下震摇2h，双层琼脂培养法测定上清中病毒含量，并计算吸附量。可从图6b中看出，在氯化钠溶液中，抗病毒MIP对噬菌体f2的吸附能力维持在25pfu/mL?32pfu/mL之间，并未随着氯化钠浓度的增加而下降，表现出良好的抗盐干扰性會K。
[0099]血液是具有一定粘稠度的液体。为了模拟血液的粘稠环境，聚乙二醇(PEG8000)被加入到 SM 缓冲溶液(NaCl 5.8g, MgSO4.7H20 2g, pH 值为 7.5 的 lmol/L 的 Tris-HCL 缓冲液50mL，2%的明胶5mL溶解于去离子水，最后定容至1L)中来增加其粘稠度。用旋转式黏度计对该缓冲液的比粘度进行测量，切变率在20s_1，温度为37°C时，其比粘度在16?18之间，与血液的比粘度接近。将1mg上述抗病毒MIP和NIP加入含103pfu/mL f2噬菌体的缓冲液中，缓冲液还分别含有5%、10 %、15%、20 %的聚乙二醇。室温下震摇2h，双层琼脂培养法测定上清中病毒含量，并计算病毒MIP的吸附量。图6c显示，抗病毒MIP对f2噬菌体的吸附容量在不同浓度PEG8000的缓冲液中均为36pfu/mg?40pfu/mg。虽然PEG8000对病毒颗粒的具有良好的亲和力和粘性，但并不能干扰抗病毒MIP对靶病毒的特异性吸附能力。证明本发明所制备的抗病毒MIP适合在血液等粘稠的液体中使用。
[0100]将已经吸附了 f2噬菌体的上述抗病毒MIP和NIP，置于纯水中震荡30分钟并重复6次，再次测定其吸附特性；再震荡重生，再测定吸附特性，分别测定第O次、第2次、第4次和第6次循环后的吸附容量，实验结果如图6d所示。从图上可以看出，经去离子水洗涤再生的抗病毒MIP，连续使用6个循环，MIP的吸附能力并未发生明显下降。
[0101 ] 试验例5抗病毒MIP的抗感染特性
[0102]利用病毒感染靶细胞形成的噬菌斑数量，检测被抗病毒MIP吸附的病毒是否具有对宿主菌的感染能力。不同浓度实施例1中制备的抗病毒MIP或对比例I中制备的NIP(10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL)与 200uL 含 200pfu f2 噬菌体的缓冲液反应 2h后，双层琼脂培养法测定上清液中的病毒含量(pfu/mL)，并计算吸附量(pfu/mg)。图7a显示，在f2噬菌体的浓度为103pfu/mL条件下，随着抗病毒MIP浓度增加，其抗病毒感染性能增强，呈现明显的剂量-效应关系；而阴性对照NIP浓度与抗病毒感染能力无相关性。这是因为被抗病毒MIP吸附的噬菌体无法再感染其宿主大肠杆菌，因此抗病毒MIP可显著降低病毒的感染性，用于预防病毒感染，如图1所示。
[0103]在200uL含200pfu f2噬菌体的缓冲液中，分别加入10mg/mL和20mg/mL的上述抗病毒MIP和NIP，在不同时间停止反应，并利用双层琼脂培养法测定上清液中的病毒含量(pfu/mL)以及并计算吸附量(pfu/mg)。描绘不同条件下噬菌体的时间增殖曲线。图7b显示，抗病毒MIP组相比于NIP组与空白对照组(只加入f2噬菌体，不加入抗病毒MIP和NIP)，噬菌体到达增殖平台期的时间被推迟，呈现剂量依赖性生长延迟效应，而NIP组与空白对照组的生长曲线近乎吻合，说明抗病毒MIP可有效减缓噬菌体的生长，而NIP则无此效应。只有在随着时间的推移，噬菌体的增殖超过抗病毒MIP的吸附容量时，噬菌体f2的数量才逐渐恢复。
[0104]试验例6抗病毒MIP的细胞毒性
[0105]将10mg/ml实施例1中制备的抗病毒MIP或对比例I中制备的NIP加入小鼠红细胞中，4°C孵育30min后，15000g离心5min，上清液稀释10倍后，分光光度计测541nm吸光值。质量分数为1%的聚乙二醇辛基苯基醚作为阳性对照，生理盐水为阴性对照。结果如图8a所示，表明无论抗病毒MIP或NIP均未引起红细胞溶血。
[0106]将不同浓度的抗病毒MIP 和 NIP (O, 0.lmg/mL, 0.2mg/mL, 0.5mg/mL, lmg/mL, 2mg/mL, 5mg/mL, lOmg/mL)加入H印G2细胞，暴露24小时后，MTT法测定细胞的存活率。图8b显示抗病毒MIP组和NIP组对!fepG2细胞无明显毒性。
[0107]图8表明用过硫酸铵作为氧化剂制备的抗病毒MIP不会引起明显的细胞毒效应，具有良好的生物兼容性，在生物医学领域具有应用价值。
[0108]试验例7不同抗病毒MIP抑制相应靶病毒感染性
[0109]将实施例1、实施例6、实施例7、实施例8中制备的抗病毒MIP或对比例I中制备的NIP，分别以10mg/mL和40mg/mL的浓度与200uL含200pfu病毒的缓冲液混合，反应2h后，双层琼脂培养法测定上清液中的病毒含量(Pfu/mL)，并计算吸附量(pfu/mg)。图7显示各种病毒的抗MIP均对靶病毒有很好的特异性结合能力。因此本发明所公开的抗病毒MIP制备方法适用于包括人类病毒在内的多种病毒，在控制病毒的感染和增殖中有很好的应用前景。
[0110]本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于:首先，在过硫酸铵的催化下，将载体材料表面修饰多巴胺纳米膜，形成多巴胺-载体材料复合体；然后，将靶病毒与多巴胺-载体材料复合体相结合，形成病毒-多巴胺-载体材料复合体；最后从所述复合体上将所述靶病毒洗脱，即得到抗病毒分子印迹聚合物； 抗病毒分子印迹聚合物表面有所述靶病毒洗脱后形成的印迹孔穴，用于特异性结合所述靶病毒。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下: 步骤一:载体的表面修饰 向多巴胺缓冲液中加入载体材料，缓慢搅拌充分反应后弃掉缓冲液，即得到多巴胺-载体材料复合体； 其中，所述载体材料为纳米级微球、微米级微球或滤膜； 所述多巴胺缓冲液的配置方法为，将过硫酸铵与多巴胺以3:2?3:1的摩尔比溶于pH值为7.0?8.5的Tris-HCl缓冲溶液中； 步骤二:病毒-多巴胺-载体材料复合体的生成 向所述多巴胺缓冲液中加入所述多巴胺-载体材料复合体和靶病毒，缓慢搅拌充分反应后弃掉缓冲液，即得到病毒-多巴胺-载体材料复合体； 所述靶病毒在缓冲液中的浓度为108pfu/mL?1014pfu/mL ; 步骤三:洗脱靶病毒 反复洗涤所述病毒-多巴胺-载体材料复合体，使所述靶病毒洗脱，即得到抗病毒分子印迹聚合物。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，过硫酸铵与多巴胺的摩尔比为2:1。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，Tris-HCl缓冲溶液的PH值为7.5。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载体材料为二氧化硅微球。6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述靶病毒为f2噬菌体、T4噬菌体、流感病毒或手足口病病毒。7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤三的具体方法为:先用洗涤液洗涤步骤二得到的病毒-多巴胺-载体材料复合体4次?8次，每次30min?50min，再用三蒸水洗涤4次?8次，每次30min?50min，即得到抗病毒分子印迹聚合物； 所述洗涤液为，含有质量分数为3%的醋酸以及摩尔浓度为lmol/L的NaCl的水溶液。8.一种利用权利要求1所述方法制备的抗病毒分子印迹聚合物。9.一种再生如权利要求8所述抗病毒分子印迹聚合物的方法，其特征在于，将所述抗病毒分子印迹聚合物置于纯水中超声震荡20min?40min，更换纯水并重复4次?8次。
【专利摘要】本发明公开了一种抗病毒分子印迹聚合物的制备方法，首先在载体材料上修饰多巴胺纳米膜，然后将靶病毒与修饰了多巴胺纳米膜的载体材料相结合，形成病毒-多巴胺-载体材料复合体，最后再从复合体上将靶病毒洗脱，即得到相应的抗病毒分子印迹聚合物。本发明的抗病毒分子印迹聚合物可利用病毒洗脱后留下的印迹孔穴，特异性结合靶病毒，并抑制靶病毒增殖以及感染宿主；该抗病毒分子印迹聚合物具有使用特异性好、使用环境友好以及再生简单的优点，在生物免疫领域有良好的使用前景。
【IPC分类】C08G73/02, B01J20/30, C08J9/26, B01J20/26
【公开号】CN104945623
【申请号】CN201510387979
【发明人】吕斌, 刘燕婕, 石云, 刘飞, 罗密芳
【申请人】华中科技大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月3日