一种检测牛流行热病毒的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术 (Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术（Lateral Flow Assay)检测牛流行热病毒所用的引物和探针组合及其试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛流行热是由牛流行热病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)引起的牛的 急性、热性传染病。该病来势猛、传播快、发病率高，常于开始发病后10天内引起大区域流 行。发病奶牛产乳量和奶质下降，种公牛精液质量受损，部分怀孕母牛流产，有的病牛瘫痪 甚至死亡，给养牛业造成严重的经济损失。近年来，该病在我国频繁发生，部分地区的阳性 率高达81 %，严重制约了养牛业的持续健康发展，在农业部2014年印发的《牛羊常见疫病 防控技术指导意见》文件中将其列为牛重点防控的疫病。
[0003] 目前检测BEFV的主要方法有病毒分离、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、血清 中和试验、电镜检查等，但这些方法不仅操作繁琐复杂、耗时耗力，而且难以用于BEFV的现 场诊断。因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为该病的现场诊断提供新一代的 检测技术与手段。
[0004] 重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是不同于 PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶 三种酶参与。其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻 找同源序列。在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形 成复制所需的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链，对 模板上的目标区域进行指数式扩增。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在 RPA扩增体系中加入一个生物素标记的反向引物和5'荧光标记的探针，探针标记的荧光基 团30个碱基处有一个脱碱基位点（dSpacer)，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶 nfo识别切割，产生新的3'羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而使双标信 号与扩增产物的累积同步，检测结果可在抗FAM金标结合和抗生物素捕获抗体的侧流层析 试纸条上显示。
[0005] 目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，将RPA技术应用于BEFV检测还未见报 道。
【发明内容】
[0006] 本发明首次采用RPA结合侧流层析技术建立快速检测BEFV的方法，并通过特异性 和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BEFV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
[0007] 针对RPA侧流层析技术应用于BEFV临床现场快速检测领域的优点，本发明提供了 一种准确、快速、简便检测BEFV的RPA检测方法。仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提 取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩 增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时 间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行BEFV的诊治。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0009] -种用于通过RPA技术检测BEFV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物序列如SEQ ID No. 2所示，探针序列如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 正向引物：5' -AGGATGGAGAATGGTGGAGTATAGAAAACC-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0011] 反向引物：5'-【Biotin】CTCGTGGGAGCCAAGTAAGACATATCTAATGT-3'；（SEQ ID No. 2)
[0012] 探针序列：5' -【FAM】 AGGATGCACACAGATAGAACAGAGTTTGAA【dSpacer】 AATTAGATATTAAGGC【C3-spacer】-3'（探针5' -端用FAM标记，距离5' -端30个碱基左右 的位置处用dSpacer替代一个碱基，3'端用C3-spacer阻断）。（SEQ ID No. 3)
[0013] 需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp， 探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度 的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。 RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引 物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引 物进行优化、筛选才能得到。
[0014] 本发明还提供了一种检测BEFV的试剂盒，该试剂盒中包含有用于通过RPA技术检 测BEFV的引物和探针组合。
[0015] 进一步的，该检测试剂盒中还包括有：BEFV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子 水和侧流层析检测试剂。BEFV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水与引物和探针组合一 起构成RPA扩增体系。
[0016] 所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置 换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白（SSB)、280mM醋酸镁（MgAc)溶液。
[0017] 所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液 (1XPBS+0. 1% Tween20)。
[0018] 所述BEFV阳性对照模板的制备方法为：分别在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的引物对的上游和下游设计引物：
[0019] 上游引物：5' -ATGTTCAAGGTCCTCATAATTACCTTG-3'（SEQ ID No. 4);
[0020] 下游引物：5' -TTAATGATCAAAGAACCTATCATCAC-3'（SEQ ID No. 5);
[0021] 以BEFV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50yL :10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 5 μ L、2. 5mM dNTP Mixture 8 μ L、LA Taq 0· 5 μ L (5U/ μ L)、模板 2 μ L， 10 ymol/L的上下游引物各2 yL，灭菌超纯水加至50 yL。反应程序为：94°C预变性3min， 然后进入94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，共进行31个循环；72°C延伸10min，最后停止于 4°C。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体（该载体为常 规的载体，商业化购买到），蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比 对，正确的重组质粒为BEFV阳性对照模板。
[0022] 具体的，一种检测BEFV的试剂盒，每50yL RPA扩增体系中含有正向引物、反向引 物各 2. 1 μ L (10 μ mol/L)，探针 0· 6 μ L (10 μ mol/L)，BEFV 阳性对照模板 2 μ L，Rehydration 缓冲液29. 5 μ L，去离子水11. 2 μ L和醋酸镁溶液（280mM) 2. 5 μ L。
[0023] 本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测BEFV的方法，步骤如 下：
[0024] (1)应用快速提取病毒RNA试剂盒提取样品中或样品病毒培养上清液的RNA，按照 Fermentas RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 RT-PCR 反应，获 得BEFV的cDNA模板；
[0025] (2)根据BEFV保守区域设计RPA特异性引物和探针，向RPA扩增试剂盒推 荐反应的50 yL扩增体系中加入正向引物、反向引物各2. IyL (10 μ mol/L)，探针 0· 6 yL(10 μ mol/L)，模板 DNA 2 yL，29. 5 yLRehydration 缓冲液，11. 2 yL 去离子水和 2. 5 μ L醋酸镁溶液（280mM)，于含有冻干酶粉的0. 2mL TwistAmp nf〇反应管中，恒温水浴 锅内38 °C反应25分钟；
[0026] (3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带 和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性。
[0027] 上述检测方法不仅可用于BEFV的现场检测，还包括非疾病的BEFV检测，包括环境 气溶胶样本中BEFV的检测。
[0028] 应用上述方法可以筛选出一套可快速有效检测出BEFV成分的引物及探针组合。
[0029] 将已知病毒滴度为1.0 X 105TCID5Q/mL的BEFV用DEPC水进行10倍系列稀释后， 提取RNA并进行反转录后进行检测，结果显示可以检测到ITCID 5。的靶标分子，证明该方法 具有较高的灵敏度。
[0030] 以Loxio2TCHD5qBEFV样品的cDNA作为模板，利用上述的引物和探针进行RPA 等温扩增，扩增产物在侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，而以其它病毒的DNA或 cDNA为模板扩增均仅显示对照带，表明该方法具有较好的特异性。
[0031] 以合成的ItcidmBEFV样品的cDNA作为模板