段和变体可W如本文中所述产生并使用本领域中已知的标准技 术测试功能的存在。因此，普通技术人员可W容易地制备和测试本发明多肤的片段和变体 并确定是否该片段或变体相对于全长或非变体多肤保持功能活性。
[0042] 包括在本发明范围中的多核巧酸和多肤也可W依据与本文中特别示例说明的本 发明的那些序列具有更特别的同一性和/或相似性范围来定义。序列同一性通常大于 60 %，优选大于75 %，更优选大于80 %，甚至更优选大于90 %，且可W大于95 %。序列的 同一性和/或相似性与本文中示例的序列相比可W是49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、 59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、 84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。除非另外指明，如本文中使用 的两个序列的百分序列同一性和/或相似性可W使用Karlin和Altschul(1990)的算法 (如Karlin和Altschul(1993)中改进的）确定。运种算法结合到Altschul等（1990)的 NBLAST和XBLAST程序中。BLAST检索可W用NBLAST程序进行，评分=100,字长=12,W 获得具有所需百分序列同一性的序列。为获得用于比较目的的带空位比对，空位blast可 W如Altschul等（1997)中所述使用。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可W使用相应 程序（NBLAST和XBLAST)的缺省参数。参见NCBI/NIH网站。
[0043] 本发明还包括具有与本文中示例说明的多核巧酸序列充分同源W允许在标准严 格性条件下和使用标准方法（Maniatis等，1982)与该序列杂交的序列的那些多核巧酸分 子。如本文中使用的，用于杂交的"严格"条件是指其中杂交通常在6xSSPE，5xDenhar化'S 溶液，0. 1 %SDS，0.Img/ml变性的DM中在低于DM杂合体的解链溫度灯m) 20-25°C下过夜 进行的条件。解链溫度，Tm，通过W下公式度eltz等，1983)描述：
[0044] Tm= 81. 5°C+16. 6Log阳a+]+0. 41 (%G+O-0. 61 (% 甲酯胺）-600/ 双链体W碱基 对计的长度。
[0045] 洗涂通常如下进行：
[0046] (1)在lxSSPE，0. 1 %SDS中室溫下两次，15分钟（低严格性洗涂）。
[0047] 似在0. 2xSSPE，0. 1 %SDS中Tm-20°C下一次，15分钟（中等严格性洗涂）。
[0048] 如本文中使用的，术语"核酸"和"多核巧酸"是指单链或双链形式的脱氧核糖核 巧酸、核酸核巧酸或混合的脱氧核糖核巧酸和核糖核巧酸的聚合物，且除非另外限定，其包 括可与天然存在的核巧酸类似的方式发挥功能的天然核巧酸的已知类似物。多核巧酸 序列包括转录为RNA的DNA链的序列和与被转录的DNA链互补的链的序列。多核巧酸序列 也包括全长序列W及源自全长序列的较短序列。示例说明的序列的等位基因变异也落入本 发明的范围内。多核巧酸序列包括作为单个序列或在双链体中的正义和反义链。
[0049] 用于用基因转化植物细胞的技术是本领域中已知的且包括，例如，农杆菌感染、生 物弹道方法、电穿孔、氯化巧处理、阳G-介导的转化等（参见，例如，化gel等，1990;Song 等，2006;dela化na等，1987;和Klein等，1993)。美国专利No. 5, 661，017 教导了用异源 多核巧酸转化藻类细胞的方法和材料。转化的细胞可W使用本领域中已知的标准方法进行 选择、再分化和生长成包含和表达本发明的多核巧酸的植物。本发明的任何转化的或转基 因的植物细胞或植物的种子和其它植物组织及后代也包括在本发明的范围内。
[0050] 本发明还设及产生相对于野生型植物表现出提高的hcl含量和/或蛋白质功能活 性的植物的方法。在一个实施方式中，编码本发明的Hcl或突变化1蛋白的多核巧酸被引 入植物细胞中且该多核巧酸编码的多肤被表达。在一个实施方式中，一个或多个多核巧酸 并入植物细胞的基因组中且植物从该植物细胞生长。在优选的实施方式中，从植物细胞生 长的植物稳定地表达并入的一个或多个多核巧酸。
[0051] 本发明还设及用于选择具有提高的植物生长、生物量和/或对干旱条件的耐受性 水平的植物的方法和材料。在一个实施方式中，hcl基因或多核巧酸用作遗传标志物。在 特定的实施方式中，Hcl蛋白包含SEQIDN0:2的氨基酸序列或具有与全长序列基本上相 同的活性的其片段或变体。在特定的实施方式中，hcl基因或多核巧酸包含SEQIDNO: 1 或SEQIDN0:3的核巧酸序列或者其片段或变体。本发明的方法包括确定植物、植物组织 或植物细胞是否包含本发明的hcl基因或多核巧酸，和/或确定植物、植物组织或植物细胞 是否包含或表达本发明的化1蛋白。在一个实施方式中，hcl基因或多核巧酸的存在通过 筛选用于与核酸探针（例如，本发明的寡核巧酸）杂交的来自植物、植物组织或植物细胞的 核酸来确定，该核酸探针与本发明的hcl基因或多核巧酸杂交。在另一个实施方式中，hcl 基因或多核巧酸的存在通过限制性片段长度多态性（RFL巧分析，通过特定hcl核酸序列的 聚合酶链反应（PCR)扩增或通过对来自植物、植物组织或植物细胞的hcl-编码核酸测序和 鉴定基因或多核巧酸是否包含提供提高的hclmRNA水平或提高的hcl活性的序列来确定。
[0052] 本发明还设及使用提供调节的（提高的或降低的）hcl或其基因产物的表达的基 因或多核巧酸W选择表现出目标表型特征（例如，提高的植物生物量和/或生长率）的植 物、植物组织或植物细胞而进行标记辅助选择和植物育种的方法。用于标记辅助选择的方 法是本领域中已知的。
[0053] 本发明还设及可W与本发明的多核巧酸的编码或非编码序列杂交的寡核巧酸探 针和引物如聚合酶链反应（PCR)引物。本发明的寡核巧酸探针可W用于检测和定量编码本 发明的多肤的核酸序列的方法中。本发明的寡核巧酸探针可W用于PCR方法和其它设及核 酸扩增的方法中。在优选的实施方式中，本发明的探针或引物可W在严格条件下与本发明 的多核巧酸杂交。本发明的探针和引物可W任选地包含可检测标记或报告分子如巧光分 子、酶、放射性部分（例如，3H、35s、i25i等），等等。本发明的探针和引物可W是适用于其中采 用该探针和引物的方法和试验的任何长度。通常，本发明的探针和引物长度是10至500或 更多个核巧酸。长度 10-20、21-30、31-40、41-50、51-60、61-70、71-80、81-90、91-100 或更 多个核巧酸的探针和引物包括在本发明的范围内。本发明的探针和引物可W与多核巧酸序 列具有完全（100%)的核巧酸序列同一性，或者序列同一性可W低于100%。例如，探针或 引物与序列之间的序列同一性可W是99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、 70%或任何其它的百分序列同一性，只要探针或引物可W在严格条件下与本发明多核巧酸 的核巧酸序列杂交。在一个实施方式中，本发明的探针或引物与SEQIDNO: 1或SEQID N0:3的核巧酸序列或其互补序列具有70%或更高，75%或更高，80%或更高，85%或更高， 90%或更高，或者95% -100%的序列同一性。
[0054] 本发明还设及分离的Hcl多肤。在特定的实施方式中，本发明的多肤具有如SEQ IDN0:2中所示的氨基酸序列或表现出与全长氨基酸序列基本上相同的活性的其功能性片 段或变体。本发明的多肤可W使用本领域中已知的标准技术纯化。在一个实施方式中，编 码化1多肤的本发明的多核巧酸引入微生物如大肠杆菌中，且多肤在微生物中表达并随后 从其分离。
[0055] 本发明的多肤及其功能性肤片段可用于产生与本发明的多肤特异性结合的抗体， 且运类抗体包括在本发明的范围内。本发明的抗体可W是多克隆的或单克隆的，且可W使 用本领域中已知的标准方法产生和分离。在一个实施方式中，本发明的抗体与包含SEQID N0:2所示的氨基酸序列的多肤或其片段或变体特异性结合。本发明抗体的抗原结合片段 (如F油或F油2或Fv片段）可W常规地制备且也包括在本发明的范围内。
[0056] 如本文中描述的，本发明多肤的片段可W通过用蛋白水解酶（如膜蛋白酶、膜凝 乳蛋白酶或胶原酶）或用化学试剂如漠化氯（CNBr)切割本发明的多肤获得。或者，多肤片 段可W在高度酸性的环境中（例如抑2. 5下）产生。多肤片段也可W通过化学合成或使 用用包含编码本发明多肤的片段（例如，作为SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的片段的多 肤）的多核巧酸的表达载体转化的宿主细胞制备。在本文中设想的本发明多肤的片段还包 括其中多肤的全部或部分转运或信号序列被除去的多肤片段。
[0057] 本发明还设及用编码本发明的Hcl多肤的本发明多核巧酸转化的，或者表现出提 高的Hcl编码多核巧酸或该多核巧酸编码的蛋白质的表达的，或者表达W提高的表达或者 活性或功能为特征的突变hcl多核巧酸或突变Hcl蛋白或其片段或变体的细胞。在一个实 施方式中，细胞用包含编码SEQIDN0:2所示的氨基酸序列或其功能性片段或变体的序列 的多核巧酸序列转化。在特定的实施方式中，细胞用56〇10^:1和/或56〇10^:3所 示的多核巧酸序列或编码SEQIDN0:2的功能性片段或变体的序列转化。在一个实施方式 中，多核巧酸序列提供在本发明的表达构建体中。转化的细胞可W是原核细胞，例如，细菌 细胞如大肠杆菌或枯草杆菌，或者转化的细胞可W是真核细胞，例如，植物细胞（包括原生 质体）或动物细胞。植物细胞包括，但不限于双子叶植物、单子叶植物和裸子植物细胞，如 松类植物细胞。在一个实施方式中，植物细胞是来自杨属植物的细胞。植物细胞可W是来 自杂种植物（例如杨树杂交种）的细胞。动物细胞包括人类细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞 和昆虫细胞。哺乳动物细胞包括，但不限于COS、3T3和CH0细胞。
[0058] 本发明还设及植物组织和植物部分，包括但不限于源自本发明植物的植物细胞、 植物原生质体、植物可W由其再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物 或植物部分（如枝条、核、穗、穗轴、果壳、根尖、花药、种子、根、胚、胚轴、子叶、花粉、胚珠、 花粉囊、芽、梗、茎、叶、果实和花）中完整的植物细胞。本发明还设及从本发明的植物产生 的插条。在一个实施方式中，插条是根茎或接穗。在一个实施方式中，插条是来自本发明的 幼苗的茎或枝条。在特定的实施方式中，茎来自包含hcl基因或其蛋白质编码部分的杨属 植物。在一个实施方式中，杨属植物茎或枝条是来自杂交杨属植物。
[0059] 本发明还包括由包含编码本发明的Hcl多肤或提供基本上相同活性的其片段或 变体的多核巧酸的本发明植物繁殖或W其它方式从本发明的植物衍生的植物和植物组织。 本发明的范围内包括的种子包括从本发明的植物与另一植物如近交植物的杂交产生的杂 种种子。在一个实施方式中，本发明的植物和/或其它植物是纯合的近交系。在一个实施方 式中，其它植物可W是表现出所需农艺学性状和/或果实品质的植物。在特定的实施方式 中，其它植物是表现出对一种或多种植物病原体、疾病或除草剂的抗性的植物。本发明还设 及从本发明的杂交种子或插条生长的杂种植物。本发明还设及本发明的植物组织嫁接于其 上的植物。在一个实施方式中，多核巧酸编码的化1蛋白包含SEQIDN0:2所示的氨基酸 序列或具有与全长序列基本上相同活性的其片段或变体。在进一步的实施方式中，多核巧 酸包含SEQIDNO: 1或SEQIDNO:3所示的核巧酸序列。本文中提及或引用的全部专利、 专利申请、临时申请和公开通过引用全文引入，包括所有附图和表格，达到它们与本说明书 的明确教导不矛盾的程度。
[0060] 实施例
[0061] W下是阐明实施本发明的过程的实施例。运些实施例不应理解为限制。所有百分 比是W重量计且所有溶剂混合物比例是按体积计，除非另外说明。
[0062] 应理解，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明的目的，且根据本文描述的实 施例和实施方式的各种改变或变化是本领域技术人员容易想到的并包括在本申请的精神 和范围内及所附权利要求的范围内。另外，本文中公开的任何发明或其实施方式的任何 元素或限制可W与本文中公开的任何其它发明或其实施方式的任何和或所有元素或限制 (单独地或W任何组合方式）组合，且所有运样的组合包括在本发明的范围内但不限于运 样的组合。
[0063] 实施例1
[0064] 植物材料、繁殖和生长测量
[0065] 用于鉴别hcl的系谱是杂种雌性亲本52-225(毛果杨（Populus