一种改善转录通读的慢病毒载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改善转录通读的慢病毒载体及其应用。
【背景技术】
[0002] 人免疫缺陷I型病毒是获得性免疫缺陷综合征-俗称艾滋病的病原体。HIV-1也 被俗称为I型艾滋病毒。谈到艾滋病毒，人们的第一反应是恐惧和不安。科学家们却把这 种病毒改造成为基因转移工具，称之为基于HIV-1的慢病毒载体。
[0003] 慢病毒载体在临床基因治疗中的有效应用大大提高了科研工作者对其安全性的 要求。慢病毒载体在以下情况下可能会诱发肿瘤：慢病毒载体随机整合入染色质中引起插 入性突变，整合位点恰好位于原癌基因或癌相关基因座的内部或上游，由于慢病毒载体具 有转录通读的特性导致下游原癌基因转录激活或者转录本增加。由于染色质上编码序列 只占5%，因此，同时具备上述条件的可能性很小。但这些不安全性因素是存在的，目前慢 病毒载体在临床基因治疗中常被用于一些无法进行常规治疗的重症疾病。1999-2002年， Hacein-Bey-Abina等人利用y-RVs对X连锁重度复合性免疫缺陷病（X-SCID)患者进行基 因治疗。虽然治愈了接受治疗的10例中的9例病人，然而治疗后的31-68个月之中，有4 例病人相继得了白血病。后续的研究发现，Y-RVs载体偏爱于整合到原癌基因（lm 〇2，bmil 或ccnd2)之前，并激活这些基因的表达。y-RVs载体激活下游基因表达的原因有两点：1、 Y-RVs 5'端长末端重复序列（LTR)上的增强子元件能激活整合位点附近基因的表达；2、 y-RVs 3'端LTR具有很高转录通读活性，从而引起整合位点下游基因转录表达。慢病毒载 体同样存在转录通读现象，尤其是SIN-LVs。SIN-LVs是在前几代LVs的基础上删除了 LTR U3中的启动子和增强子元件。SIN-LVs的优化方案降低了产生重组性活病毒（RCLs)的概 率。但是，与此同时SIN-LVs转录通读率却大大的增加了。这是因为其U3区被部分删减， U3区中含有转录终止元件USE。研究发现，SIN-LVs的转录通读率比改造前通读率可能增 加了 10倍左右。如此之高的转录通读率使SIN-LVs在安全性得以提升的同时，又增加了新 的安全风险。
[0004] 为了改善慢病毒载体的转录通读，就需要优化慢病毒载体的转录终止元件LTR，以 增强其转录终止能力。然而，LTR结构和功能的复杂性极大的增加了改善自灭活慢病毒载 体转录通读率的难度。LTR不仅含有重叠的转录起始/转录终止元件，还在病毒包装过程中 参与病毒基因组RNA的转录，在宿主细胞中参与病毒RNA逆转录成cDNA的过程，并且还参 与病毒整合到细胞染色质中过程。因此，对LTR的优化设计必须同时考虑到对所有上述病 毒生理过程的影响。这给慢病毒载体通读率的改善研究增加了难度。
[0005] 科学家们已经尝试了许多降低SIN-LVs转录通读的方法。Yang等曾尝试在 SIN-LVs LTR中分别添加I型白血病毒腺苷酸化信号元件，人的生长激素基因3'端小内含 子元件和突变tRNA基序元件来改善SIN-LVs的转录通读。结果发现所有的这些优化方法不 仅没能增加SIN-LVs的转录终止能力，反而增加了 SIN-LVs的转录通读。Hanawa等人选取 鸡P-Globin 5' HS4隔离子的核心元件（0.25kb)插入到慢病毒载体中，发现慢病毒载体 的转录通读得到了改善。而且，将该元件反向插入，转录通读的改善更为明显。Ramezani等 人将人的T细胞隔离子（a / S BEAD-1)和鸡的0 -Globin 5' HS4隔离子核心序列融合得 到一个新的元件，称为FB元件（77bp)。他们研究发现，FB元件具有与1. 2kb完整5' HS4 隔离子同样有效的增强子阻断功能。将FB元件插入到SIN-LVs中，载体的转化风险显著 降低。在SIN-LVs LTR中补充USEs元件也有助于改善转录通读。Schambach等人选择了 七种上游多聚腺苷酸化增强元件USEs (来自病毒或细胞基因的），插入到SIN-LVs LTR的 A U3区域，以改善转录通读。研究发现:V LTR的A U3中插入来自SV40病毒的USE元件 (2父5￥401^￡，长8(^口），病毒载体的转录通读率显著降低，其滴度增加2.8倍，且基因表达 也有1. 6-2. 2倍的增加。然而，上述方法还没能消除转录通读现象，也没有使转录通读水平 降低到安全范围。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种改善转录通读的慢病毒载体及其应用。
[0007] -种改善转录通读的慢病毒载体，所述载体是将HIV-1慢病毒载体的LTR区域改 造成其A U3与泡沫病毒（foamy virus)R-U5区形成嵌合体LTR(ra LTR);或者在HIV-1 为基础的慢病毒载体的骨架上反向插入两个拷贝的鸡P-Globin HS4隔离子的全序列 (2. 4C ,2X1. 2-kb)；
[0008] 所述HIV-1慢病毒载体的序列如序列表SEQ ID NO. 1所示；
[0009] 所述嵌合体LTR的序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 所述2. 4C的序列如序列表SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 所述嵌合体FH LTR指的是慢病毒载体A U3与泡沫病毒（foamy virus) R-U5区融 合形成全新的嵌合体LTR。
[0012] -种改善转录通读的慢病毒载体在表达基因工程产物中的应用。
[0013] 本发明的有益效果：本发明通过自行设计的基于RT-qPCR检测慢病毒载体转录通 读的方法将慢病毒载体的转录通读率量化。成功地测定了第三代自灭活慢病毒载体（FUGW 病毒包装体系）在293T细胞中的转录通读率，约为68%。而野生型HIV-1的通读率约为 24%。本发明筛选出了降低慢病毒载体转录通读率的方法。其中，在慢病毒载体中使用嵌 合体冊LTR后在293T细胞中将通读率降低到15%左右。转录通读率的大幅度降低，在很 大程度上提高了第三代慢病毒载体在基因治疗中的安全性。但是，改造后病毒的滴度变化 数据还需通过后续实验加以补充。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明的实验路线图。
[0015] 图2为FUGW，FLV载体示意图。
[0016] 图3为RT-qPCR检测各优化的转移载体的转录通读率。
[0017] 图4为FACS检测EGFP阳性率。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0019] 本发明将模拟病毒载体整合入染色质中的状况，检测携带有嵌合体FH LTR的慢病 毒载体原病毒转录通读率的变化。另外，本发明还设计了其他几种新的优化方案来改善慢 病毒载体转录通读水平。本发明设计了 10种优化方案（见表1)以期对SIN-LVs的转录通 读率进行优化，并分别在两个不同层面上检测优化方案的有效性（实验路线如图1所示）。
[0020] 首先，利用PEGFP-N1报告载体系统检测插入这些优化元件以后LTR的转录终止能 力。在此基础上，利用原病毒载体系统模拟载体整合在染色质上的情况，检测并验证优化方 案改善慢病毒载体转录通读的有效性。
[0021] 表1改善慢病毒载体转录通读率的10种方案
[0022]
[0024] -、改善慢病毒载体转录通读的优化设计及其构建
[0025] 1. 1FLV载体的构建
[0026] FUGW载体是目前被广泛使用的第三代自灭活慢病毒载体包装系统中的转移载 体。本发明以FUGW载体作为研究慢病毒载体转录通读率的基础载体。通过化学合成 (Invitrogen)的方法，合成人泡沫病毒（Human Foamy Virus)的R-U5片段，通过融合PCR， 与慢病毒载体上的A U3融合成嵌合体LTR(ra LTR)。随后克隆至FUGW的两端，代替其两端 原有的LTR，形成模拟整合入染色质上的原病毒载体。。。
[0027] R (repeat sequence)是HIV-1长末端重复序列LTR中的一段序列，位于HIV-1基 因组序列的两侧。在病毒的转录和逆转录过程中都起来非常重要的作用。由于R元件含有 转录终止的核心序列polyA signal，通过增加一个R元件来改善慢病毒载体的转录通读。 为了检测增加R元件以后，病毒载体是否可以顺利的起始转录，需要构建FGW和FGW-2R这 两个载体（图2)。
[0028] R的序列中含有一个Afl II酶切位点，在Afl II位点处将R元件打开，插入R在 Afl II位点下游的序列和Afl II位点上游的序列（Afl II下游序列和Afl II下游序列的 融合序列，简称2R-insert sequence)从而获得含有两个R元件的重复序列（2R元件）。
[0029] FUGW载体在5'端和3'端各有一个R元件，为了便于对R元件的酶切操作，发明 人先去掉FUGW载体中的部分序列，使之只含有3'端的一个R元件。用Apal和PacI酶切 FUGW载体，去除Apal-PacI之间的序列。骨架片段补平以后，用连接酶连接，载体自连获得 中间载体FUGW-A/P。在中间载体F