一种脱甲基t-2毒素及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新的隐蔽态毒素，特别是一种脱甲基Τ-2毒素。本发明还涉及该 毒素的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] Τ-2毒素是镰孢菌（/feiari? spp)产生的倍半萜烯类真菌毒素，结构如下所示：
[0003] 历史上出现的T-2毒素引起的疾病的大暴发，主要都是由于摄入了含有过量的 T-2毒素及其有毒代谢产物的食物引起的。动物及人类在一定范围内摄入T-2毒素后会通 过自身的解毒机制来进行代谢，主要是体内的I相和II相生物转化反应代谢。T-2毒素的 代谢主要有单个基本反应，包括水解(酯基)、氧化（T-2毒素C-3脂肪族羟基化）和还原(单 端孢霉烯12, 13-环氧环)，以及结合反应(葡萄糖苷酸化等)。
[0004] 不同的动植物代谢T-2毒素产生的代谢产物也各有差异，现在已知的代谢产物主 要包括HT-2 toxin，NEO toxin，3' -OH-T-2, de-印oxy-HT-2等二十几种产物。每种产物 的毒性也有很大差异，C12与C13间环氧环是A型单端孢霉烯族毒素的必需毒性基团，在大 鼠皮肤刺激实验中，脱环氧T-2毒素毒性是T-2毒素毒性的1/400。强毒性A型单端孢霉烯 族毒素都含有环氧基团，当环氧环被打开后，毒素的毒性作用基本消失。
[0005] 有些代谢产物，例如哺乳动物代谢T-2毒素后的II相代谢产物T-2-GluA和 HT-2-GluA用检测T-2毒素的常规方法很难检测到，这类真菌毒素被称为隐蔽态真菌毒素。 由于真菌毒素与生物大分子结合导致极性、溶解性及分子量发生变化，很难用常规的方法 检测到。但这类隐蔽态的真菌毒素在某些条件下能水解为真菌毒素原型，从而保持了其原 有毒性，隐蔽态真菌毒素是一种潜在的食品危害。目前制约隐蔽态真菌毒素检测的主要原 因是缺之隐蔽态真菌毒素标准品。
[0006] 现在已知的隐蔽态真菌毒素合成方法中，化学法一般是运用Koenigs-Knor反应， 用这种方法Grabley等和Zill等合成了 ZEN结合物。对Koenigs-Knor反应稍加修改合成 了 D0N-3G和D0N-15G。虽然化学法能够大量生产隐蔽态真菌毒素，但是试剂昂贵，并且不适 用于所有真菌毒素，隐蔽态T-2毒素的合成就不适合用化学法，因为这个反应最后一步需 要脱去乙酰基，这容易使T-2毒素上的乙酰基也脱去，所以该法不适用于合成T-2-GluA。还 有一种方法是通过发酵过程产生ZEN-14-Glu，运用Saccharomyces cerevisiae基因工程 菌株来表UDPGT。另一种方法就是利用动物体内的UDPGT酶来合成糖苷酸化合物，有报道用 酶法合成了 ZEN及其五种代谢物的糖苷酸结合物，采用大鼠和人的肝微粒体中的UDPGT合 成了 DON-8-GluA和DON-15-GluA，采用小鼠、大鼠、人、猪肝微粒体酶法合成了 T-2毒素和 HT-2毒素的葡萄糖苷酸化合物。不管使用哪一种方法，隐蔽态毒素标准品的合成成本均较 高，也较为耗时。
[0007] 很多药物的代谢都要通过肝脏，在肝脏中进行I相和II相反应，I相反应主要包 括氧化、脱甲基化和水解反应。一些化合物经过I相的反应后，非极性的脂溶性化合物变成 机性和水溶性较高的代谢物。脱甲基反应一般是P450酶的作用产生，而且一般只产生在 0-甲基位和N-甲基位；一些金属也会发生脱甲基化反应，但是一般都是有微生物参与的， 是由于微生物介导的电子传递，使甲基去除。例如：Hg的甲基化是在SRB硫酸盐还原菌，IB 铁细菌等参与下实现的，通常维生素B等可以提供微生物的碳源；有机化合物的脱甲基反 应在化工工业中也较常用，例如：在催化氢化的条件下，甲苯和二甲苯都可以脱去甲基生成 苯，甲基萘也可以脱去甲基生成萘，这都是制备苯和萘的工业方法。然而，之前的文献报道 的T-2代谢产物中未发现有脱甲基T-2毒素，T-2毒素在化学反应下能发生脱甲基反应也 未见报道。
【发明内容】
[0008] 本发明首次发现并制备了脱甲基T-2毒素，为食品安全性提供了一种新的检测方 法，该方法简单方便且成本大幅度降低。
[0009] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是： 一种脱甲基T-2毒素，其结构为：
[0010] 脱甲基T-2毒素是发明人在实验过程中的意外发现，之前的文献均没有报道T-2 代谢产物中存在脱甲基T-2毒素。发明人在T-2毒素的代谢产物中发现了脱甲基T-2毒素。 脱去了甲基的脱甲基T-2毒素仍然保留T-2毒素的毒性基团，毒性和T-2毒素差不多，但是 其制备和检测均方便容易得多。
[0011] 优选地，脱甲基T-2毒素由T-2毒素在Tris-HCl缓冲液中脱甲基而制成。反应式 如下所示：
[0012] 本发明还提供一种脱甲基T-2毒素的制备方法，包括：往T-2毒素中加入 Tri s-HCl缓冲液，保温一段时间。该方法转化率高、产量大、纯度高、成本低，不需要大型仪 器和特殊培训的专业操作人员，样品不需要特殊前处理，可以作为脱甲基T-2毒素标准品 大量生产。
[0013] 优选地，Tris-HCl缓冲液的浓度为20~100mM，pH为L 1~9· 0, Tris-HCl缓冲液与 T-2毒素的比例为（6~10)yL:(l~5) yg，优选8 yL: 3 yg。优选地，Tris-HCl缓冲液液 中包含有18(：12;进一步优选地，Tris-HCl缓冲液中含有5mM MgCl 2。
[0014] 优选地，T-2毒素与Tris-HCl缓冲液的反应温度是20~50 °C，反应时间是 50~150min。优选地，往T-2毒素中加入Tris-HCl缓冲液，于37°C水浴保温90min。
[0015] 优选地，该方法还包括步骤：加入三氯甲烷，离心，取三氯甲烷层，氮气吹干。
[0016] 进一步优选地，离心是在16000g下离心10min。进一步优选地，氮气吹干后，放 入-20 °C冰箱冻存。
[0017] 本发明还提供使用本发明的制备方法制成的脱甲基T-2毒素标准品。在经历上述 制备方法的步骤之后，得到的脱甲基T-2毒素进一步纯化后可以作为标准品应用。所述纯 化可采用本领域所熟知的那些技术。
[0018] 本发明还公开了脱甲基T-2毒素用于食品安全性检测的用途。具体而言，可制备 脱甲基T-2毒素的标准品，用于检测食品(例如水产品冲是否存在脱甲基T-2毒素，以及脱 甲基T-2毒素的含量，从而监测食品安全性。
[0019] 本发明还提供一种脱甲基T-2毒素的检测方法，包括：取试验样品，用含有乙醇胺 的甲醇水溶解样品，震荡均匀后过滤，用脱甲基T-2毒素作为标准品，以LC-MS/MS全扫描模 式对样品进行扫描。所述试验样品为待检测样品，例如水产食品样品。
[0020] 优选地，取吹干的试验样品，用重量比3:7~3:10的甲醇水溶解，其中所述甲醇水 含有0. 05%~0. 15%重量体积比的乙醇铵，然后涡旋震荡5~15min，并过0. 22~0. 25 μ 1的滤 膜，以LC-MS/MS全扫描模式对样品进行扫描，将得到的图谱与标准品的图谱进行比较。
[0021] 本发明的有益效果是： 本发明提供的脱甲基T-2毒素是首次发现的T-2毒素的代谢产物。该毒素是一种隐蔽 态毒素，仍保留T-2-毒素的毒性基团，毒性与T-2毒素相当。因而，当其存在于食品中时， 如果检测不出这种隐蔽态毒素，会导致严重的食品安全性问题。本发明提供了脱甲基T-2 毒素及其标准品，能够检测食品中是否存在脱甲基T-2毒素这种隐蔽态毒素，从而确保食 品的安全性。
[0022] 现有技术中，一般通过检测T-2毒素及其代谢产物来作为监测食品安全性的指标 之一。但是，T-2毒素相关的隐蔽态毒素的检测目前受到制约，主要原因是缺乏隐蔽态真菌 毒素标准品；同时，标准品合成成本较高，较为耗时。而本发明发现了新的T-2毒素代谢产 物一一脱甲基T-2毒素，为食品安全性检测提供了一种新的途径。并且，脱甲基T-2毒素的 制备方法简单，一步合成，相对于传统的T-2毒素相关标准品，节省大量步骤、试剂和时间。 并且脱甲基T-2毒素能大量合成，从而能够十分容易地制备出充足的标准品，供检测之用， 大幅降低了标准品合成的成本以及检测成本。与使用现有的T-2毒素相关的隐蔽态毒素进 行检测相比，使用脱甲基T-2毒素标准品进行检测，方法简单方便，成本大幅减低，具有意 想不到的效果。
[0023] 脱甲基T-2毒素是一种还未见报道的新物质，它是以T-2毒素作为前体，放入 Tris-HCl缓冲液中发生脱甲基反应，进一