rate) :5 Arb ;离子 传输管温度（capillary temperature) :35CTC ;管径电压（tube lens) :60. 00 V0
[0030] 实施例1九里香有效成分的提取方法 取干燥的九里香药材(嫩枝)4. 2 Kg粉碎，在5L 75%的乙醇中回流提取，每批次药材提 取3次，每次3小时。合并回流提取液，减压浓缩乙醇，得到糖浆状总浸膏。总浸膏用水超声 悬浮，悬浮液用二氯甲烷萃取，萃取比例为I: I (v: v)，萃取4次，合并及减压浓缩，所得粗 提取物在硅胶柱上，以乙酸乙酯-石油醚进行梯度层析分离，收集乙酸乙酯洗脱部分，旋转 蒸发除去溶剂，得到目标组分，其收率约为0. 09%。将提取物溶于等量的甲醇中，在紫外-可 见吸收光谱仪和荧光光谱仪下测其紫外吸收光谱（图1)和荧光光谱（图2)。
[0031] 实施例2半制备色谱 条件为，仪器：Waters2695 ;检测器：Waters2475 FLR ;色谱柱：Agela Venusil XBP C18 (10 mmX250 mm，5 μm);流速：3mL/min ;柱温：35。C ;检测波长：λ ex=352 nm, λ em=458 nm;等度洗脱且甲醇和纯水按照9:11的比例。进样200 μ1 20mg/mL的样品，收集的 23-27min的组分，如图3。
[0032] 实施例3核磁共振谱确定单体化合物结构 我们利用ESI-MS，13C-NMR和1H-NMR对目标化合物的结构进行了表征，对其氢原子和 碳原子进行了指认归属。推导出产物结构为六甲氧基二氢黄酮-鼠李糖基-鼠李糖苷 (hexamethoxy flavanone-〇-[rhamnopyranosyl_(l 一 4)_rhamnopyranoside])，分子式是 C33H44O17，相对分子量为712. 26。化学结构式为：
[0033] 如图4所示，ESI-MS图中能看到黄酮苷元的离子峰信号；如图5所示，六甲氧基黄 酮对应为[M+H] +:405. 15，[M+Na] +:427. 14 ;二氢黄酮容易开环转为异构体查耳酮，进而裂 解得到一系列碎片分子离子峰，得到包括m/z=374. 12, 362. 32, 347. 09, 331. 11的离子峰。
[0034] 图6所示，13C-NMR给出了 33个碳信号峰；如图6A所示，δ =110. 58 (C-4"）， 108. 56 (C-Γ ' '），105. 95 (C-4, ' '），104. 28 (C-5, '），92. 06 (C-2, '），90. 76 (C-Γ '）， 78. 94 (C-3 ' ' '），76. 83 (C-3 ' '），60. 84 (C-2 ' ' '），60. 47 (C-5 ' ' '），是鼠李糖上十个碳原子信 号，δ 26.05, δ 25.09,是鼠李糖上甲基的碳原子信号。还有15个属于黄酮母核的芳香碳 信号，13C-NMR δ =188. 6 (C-4)，162. 03 (C-3,），161. 01 (C-5,），158. 81 (C-5)，157. 73 (C-7)， 156. 01 (C-9)，155. 51 (C-6)，154. 18 (C-4'），153. 39 (C-Γ )，139. 46 (C-8)，137. 8 (C-10)， 135. 2 (C-6'），130. 5 (C-2'），72. 39 (C-2)，45. 31 (C-3)。其中 δ =188. 6 是黄酮 C-4 的特征 信号，根据C2-C3系统推断其是二氢黄酮，δ =56. 40, 56. 44, 56. 61，56. 74, 56. 80是黄酮上 甲氧基上的碳信号。分子结构式如下：
如图7、表1所示，根据1H-NMR化学位移，峰型和积分面积，进一步证实目标化合物的结 构。1H-NMR (400 MHz，DMSO) δ =1. 14(3H)和δ=1.24(3Η)是典型的鼠李糖甲基的质子引 起的化学位移。S 3. 6-4.0有典型的甲氧基上的质子信号，且分成六组，说明黄酮苷元上 有6个甲氧基。其中，δ =〇 ppm是对照品四甲氧基硅烷（TMS)峰，δ =2. 5 ppm是氖代二甲 亚砜峰，δ =3. 4 ppm是氖代二甲亚砜的水峰。
[0035] 表1 HMFRR的核磁共振氢谱分析
实施例4MTT法检测目标药物对结肠癌细胞HT-29增殖抑制作用 方法：选取处于对数生长期且状态良好的细胞，胰酶消化，用血球计数板计数，培养基 稀释制得8 X 104~1 X IO5个/mL的细胞悬液，然后在96孔板中每孔加入100 μL稀释液，于 37 °C、5 % CO2培养箱中培养24 h;目标药物用DMSO溶解，并经过0.22 μ m的滤膜过滤除 菌。用DMSO将一级母液稀释成不同浓度梯度的二级母液，再用培养基将二级母液稀释100 倍得到加药终浓度。溶液中DMSO的浓度为I wt%;去除旧的培养基，每孔加入100 PL含不 同浓度目标药物的培养基，设置空白对照组，溶剂对照组，每组设6个复孔，培养箱中继续 孵育24 h;移除含药培养基，每孔加入100 PL无血清无酚红的RPMI 1640培养基与10 PL 5mg/mL的MTT溶液，培养箱中继续培养4 h ;吸去各孔上清液并加入100 μL DMS0,摇匀20 min，充分溶解，用酶标仪于570 nm波长处测定每孔的OD值，并计算细胞的存活率和药物作 用的IC50值。存活率（％)=(实验组光吸收值-溶剂对照组光吸收值）/ (空白对照组光吸 收值-溶剂对照组光吸收值）X 100%。
[0036] 如图8所示，随着目标药物浓度的增加对HT-29的活性有所下降，可以得知，目标 药物抑制肿瘤细胞的增殖。浓度在60 μ g/mL内HT-29细胞活性均在80%以上，说明目标 药物细胞毒性较低。
[0037] 实施例5MTT法检测目标药物对结肠癌细胞HT-29与基质成分Fn (粘连蛋白）粘 附的影响 方法：包被基质膜：将Fn溶液用无血清培养液稀释为10 μ g/mL的工作液，于96孔板 中每孔加入包被液100 μ L，在37 °C、5 % CO2 (V/V)的培养箱中继续培养24 h; BSA封 闭：吸出培养板中工作液，将要测试孔每孔加入100 yL I wt% BSA溶液，置于37 °C、5 % CO2 (V/V)的培养箱中封阻I h后，用无菌PBS溶液清洗3次，彻底吸弃PBS ;接种细胞：取 对数生长期HT-29细胞，消化后并调整细胞浓度为2 X IO5 / ml，与目标药物混合使之终浓 度分别为1、1〇、30 yg/mL，在已经包被过Fn的96孔培养板中，每个孔分别加入100 μL，另 设空白对照组、溶剂对照组，每组设6个复孔，在常规培养箱中培养I h; MTT比色法检测： 小心吸弃培养液，PBS清洗3次，除去未粘附细胞，于96孔板中每孔加入含10 PL 5 mg/mL MTT的无血清无酚红培养液100 μL，继续孵育4 h，弃去上清，每孔加入100 μL DMS0,振荡 摇匀20 min，溶解后使用酶标仪检测570 nm处的OD值。相对粘附率（％) =用药组OD值/ 空白对照组OD值X 100%。
[0038] 如图9所示，目标药物在浓度30 yg/mL范围内，随着浓度的增加，对结肠癌细胞 HT-29与Fn粘附的抑制率逐渐增大。因此，目标药物可以阻断细胞外基质与癌细胞表面整 合素的结合和粘附。
[0039] 实施例6荧光显微镜拍照法考察目标药物对结肠癌细胞HT-29与HUVECs粘附的 影响 方法：取医院健康产妇分娩后新生婴儿的脐带，迅速放于生物安全柜内，无菌条件下将 其放入提前装有预热的PBS培养皿中；找出脐静脉用预热的PBS冲洗3次以上，后灌入预 热好的0.1 wt % II型胶原酶溶液，后将其浸于事先温好的双蒸水的无菌烧杯中，消化20-30 min，使胶原酶溶液缓慢流入装有含10wt%标准胎牛血清的20 mL M-199培养基的50 mL离 心管里；离心，弃上清，加入M-199培养基并转移至细胞培养瓶，置于37 °C、5 % CO2 (V/ V)的培养箱中培养；培养4-5 h后换液处理，洗去未贴壁细胞；待细胞生长融合成单层细胞 后，弃去培养液，用PBS冲洗2-3次，用胰酶消化后传代培养。选取处于对数生长期且状态良 好的人脐静脉内皮细胞，经胰蛋白酶消化后，配成细胞悬液。于每孔500 PL接种到24孔板， 置于37 °C，5 % CO2 (V/V)培养箱中培养，使其生长到覆盖率达到80%-90%以上时，去除旧 的培养基，用无菌PBS溶液洗涤一次，再于每孔中加入500 PL含刺激因子IL-I β浓度为1 ng/mL的培养基，以增加其粘附癌细胞的能力，另设空白对照组，培养箱中继续孵育4 h，以 激活内皮细胞；在这期间将结肠癌细胞HT-29用胰酶溶液消化后，配成细胞悬液。1000 rpm 离心5min，吸弃上清液，取I mL PBS