ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)的浓度为2 μΜ，糖原合成酶激酶_3抑制剂(牌号为ΒΙ0)的浓度为I μ Μ，砸酸钠的浓度为2 μ g/L，碳酸氢钠的浓度为400mg/L，Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)的浓度为2 μ M。
[0045]2)将氢氧化钠加入至上述混合物Wl中以将pH调至7.8制得混合物W2 ；
[0046]3)将上述混合物W2通过具有0.2 μ m直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A3 ο
[0047]制备例4
[0048]I)将DMEM培养基、F12培养基、砸酸钠、维生素C、碳酸氢钠、胰岛素、激活素A、骨形成蛋白4、Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)、糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)和糖原合成酶激酶_3抑制剂(牌号为ΒΙ0)混合制得混合物Wl ;其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:4，维生素C的浓度为80 μ g/ml，胰岛素的浓度为90 μ g/ml，激活素A的浓度为95ng/ml，骨形成蛋白4的浓度为85ng/ml，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为CHIR99021)的浓度为45 μ M，糖原合成酶激酶-3抑制剂(牌号为ΒΙ0)的浓度为50 μ M，砸酸钠的浓度为30 μ g/L，碳酸氢钠的浓度为600mg/L，Rho蛋白激酶抑制剂(牌号为Y27632)的浓度为20 μ M。
[0049]2)将氢氧化钠加入至上述混合物Wl中以将pH调至7.8制得混合物W2 ；
[0050]3)将上述混合物W2通过具有0.2 μ m直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基A4o
[0051]制备例5
[0052]a、将DMEM培养基、Fl2培养基、维生素C、砸酸钠、500mg碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子和牌号为SB431542的转化生长因子β信号通路抑制剂混合充分得到混合物W3 ;其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:2，维生素C的浓度为50 μ g/ml，胰岛素的浓度为55μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为45ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为25 μ Μ，砸酸钠的浓度为20 μ g/L,碳酸氢钠的浓度为500mg/L。
[0053]b、将氢氧化钠加入至上述混合物W3中以将pH调至7.8制得混合物W4 ；
[0054]C、将上述混合物W4通过具有0.2 μπι直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基Bl0
[0055]制备例6
[0056]a、将DMEM培养基、Fl2培养基、维生素C、砸酸钠、500mg碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子和牌号为SB431542的转化生长因子β信号通路抑制剂混合充分得到混合物W3 ;其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1: 1，维生素C的浓度为2 μ g/ml，胰岛素的浓度为4yg/ml，血管内皮生长因子的浓度为5ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为3 μ Μ，砸酸钠的浓度为2 μ g/L,碳酸氢钠的浓度为200mg/L。
[0057]b、将氢氧化钠加入至上述混合物W3中以将pH调至7.8制得混合物W4 ；
[0058]C、将上述混合物W4通过具有0.2 μπι直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基Β2ο
[0059]制备例7
[0060]a、将DMEM培养基、Fl2培养基、维生素C、砸酸钠、500mg碳酸氢钠、胰岛素、血管内皮生长因子和牌号为SB431542的转化生长因子β信号通路抑制剂混合充分得到混合物W3 ;其中，DMEM培养基与F12培养基的体积比为1:4，维生素C的浓度为90 μ g/ml，胰岛素的浓度为95μg/ml，血管内皮生长因子的浓度为100ng/ml，转化生长因子β信号通路抑制剂的浓度为45 μ Μ，砸酸钠的浓度为50 μ g/L,碳酸氢钠的浓度为600mg/L。
[0061]b、将氢氧化钠加入至上述混合物W3中以将pH调至7.8制得混合物W4 ；
[0062]C、将上述混合物W4通过具有0.2 μπι直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基Β3ο
[0063]实施例1
[0064]I)将培养皿用Matrigel基质胶进行包被(当然使用玻璃连粘蛋白Vitronect1n亦可)2h ;然后在37°C的水浴中复苏冻存的人类多能干细胞，并将该细胞接种至上述培养基中，然后加入E8多能干细胞培养液(购自Life Technologies公司)在37°C下进行培养，并且每天更换培养基，直至多能干细胞增殖到80%融合度(confluency)时，接着以0.5mMEDTA(PH = 8.0，渗透压(Osmolarity) = 340m0sm)进行消化传代以保持了人多能干细胞细胞团的状态。当需要单细胞传代时，应用Trypsin酶(当然TrypLE Express酶也可以)消化，并向培养基中加入牌号为Y-27632的Rock抑制剂(工作浓度为10 μ M，提高细胞的存活率)培养24h。
[0065]2)去除培养基，以PBS缓冲溶液清洗3次，接着用Trypsin(胰蛋白酶)消化细胞5分钟至单细胞状态，以面积比1:8传至新的用Matrigel基质胶或者Vitronectin包被的培养皿中，加入细胞培养基A2在37°C下培养I天；接着更换细胞培养基Al在37°C下培养I天制得中内胚层前体细胞。
[0066]3)在37°C下，将上述中内胚层前体细胞于细胞培养基BI中培养3天得到细胞D1，其中，每天更换培养基。
[0067]实施例2
[0068]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D2，所不同的是将细胞培养基Al换成细胞培养基A3。
[0069]实施例3
[0070]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D3，所不同的是将细胞培养基Al换成细胞培养基A4。
[0071]实施例4
[0072]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D4，所不同的是将细胞培养基BI换成细胞培养基B2。
[0073]实施例5
[0074]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D5，所不同的是将细胞培养基BI换成细胞培养基B3。
[0075]对比例I
[0076]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D6，所不同的是细胞培养基Al不含有激活素A。
[0077]对比例2
[0078]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D7，所不同的是细胞培养基Al不含有骨形成蛋白4。
[0079]对比例3
[0080]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D8，所不同的是细胞培养基Al不含有砸酸钠。
[0081]对比例4
[0082]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D9，所不同的是细胞培养基BI不含有血管内皮生长因子。
[0083]对比例5
[0084]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D10，所不同的是细胞培养基BI不含有砸酸钠。
[0085]对比例6
[0086]根据实施例1的方法进行培养得到细胞D11，所不同的是细胞培养基BI不含有转化生长因子β信号通路抑制剂。
[0087]检测例I
[0088]首先，用trypsin消化上述细胞Dl至单细胞状态，用PBS缓冲溶液轻轻摇晃重新悬浮并计数。取8万单细胞悬浮的细胞，800g离心3分钟，丢弃上清液，加入10ul含有I %BSA (牛血清白蛋白)的PBS缓冲溶液，轻轻摇晃重新悬浮细胞。加入各个检测抗体(CD31和⑶34)，轻轻混匀。在4°C下避光孵育30分钟；接着800g离心5分钟，丢弃上清，加入10ul含有1% BSA的PBS，轻轻摇晃重新悬浮细胞，最后流式细胞仪进行检测。检测结果见图2和图4。
[0089]其中，图1是人类多能干细胞的形态特征图，图2是基于⑶31+⑶34+表征细胞Dl的形态特征图，由图可知，细胞Dl已成功诱导分化为血管内皮细胞祖细胞。
[0090]图3是人类多能干细胞的细胞系图，图4是人类多能干细胞诱导分化后5天CD31和CD34的表达检测结果图，其中，CD31的抗体和PE荧光基团(Phycoerythrin)偶联，C