气等环境样品和各类食品中痕量塑化剂邻苯 二甲酸二乙酯的检测。
[0036] 本发明的机理在于：由于邻苯二甲酸二乙酯是小分子物质，只具有反应原性而没 有包被原性，而且该分子上没有能与蛋白质分子直接结合的氨基、羧基等官能团，故本发明 选择4-硝基邻苯二甲酸为原料，通过两步反应（包括酯化反应和还原反应）制备带有氨基 活性基团的邻苯二甲酸二乙酯半抗原，然后用戊二醛法将这个含氨基的半抗原与卵清白蛋 白偶联制备人工包被原，将其用于建立针对邻苯二甲酸二乙酯的荧光免疫PCR分析检测方 法。
[0037] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0038] 1)包被原实用性强：邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备具有重要的实用价 值和现实意义。本发明首次采用戊二醛法成功制备了邻苯二甲酸二乙酯人工包被原 (DEP-OVA)。该人工包被原保留了邻苯二甲酸二乙酯的结构，具有针对邻苯二甲酸二乙酯的 抗原决定簇，为建立亲和素-生物素化酶联免疫吸附分析法提供了保障。
[0039] 2)包被原稳定性好：此法合成的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原具有较好的稳定 性，在0~4°C环境下可保存12个月不变性，-20°C环境下可保存3~5年。
[0040] 3)包被原制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需特别的仪器设备，成本低 廉，容易工业化规模生产。
【附图说明】
[0041] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0042] 图1为邻苯二甲酸二乙酯半抗原红外光谱；
[0043] 图2为邻苯二甲酸二乙酯半抗原核磁共振光谱；
[0044] 图3为邻苯二甲酸二乙酯半抗原、蛋白质OVA和人工包被原DEP-OVA的紫外吸收 光谱图；
[0045] 图4为间接竞争BA-ELISA免疫分析方法检测邻苯二甲酸二乙酯的标准工作曲线。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0047] 本发明的邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的制备，通过4-硝基邻苯二甲酸与乙醇 在强酸的催化作用下发生酯化反应得4-硝基邻苯二甲酸二乙酯；4-硝基邻苯二甲酸二乙 酯和锌粉、强酸发生还原反应得邻苯二甲酸二乙酯半抗原；采用戊二醛法，将所述半抗原与 卵清白蛋白偶联，即得DEP人工包被原DEP-0VA。戊二醛法反应中，邻苯二甲酸二乙酯半抗 原4-氨基邻苯二甲酸二乙酯的氨基与戊二醛一端的醛基结合，戊二醛另一端的醛基与卵 清白蛋白OVA-端的氨基结合，偶联脱水，生成了DEP人工包被原DEP-0VA。具体制备及应 用见以下各实施例：
[0048] 实施例1、邻苯二甲酸二乙醅半抗原的制备与鉴宙
[0049] (1)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备
[0050] 取洁净的容积为IOOmL三口圆底烧瓶，向瓶底装入IOg(0. 0474mol) 4-硝基 邻苯二甲酸，随后缓慢加入16. 6mL(0. 2850mol)无水乙醇，边搅拌边加入I. 65mL浓 H2S04(0 . 0 3 04mol)催化，86°C搅拌回流，直至薄板层析法（TLC)检测原料点消失为止（显色 剂：丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾；展开剂，正己烷：乙酸乙酯=5:1);搅拌回流9h后反 应完成；蒸馏除去未反应的乙醇和生成的水；此时将液体趁热倒入冰水中，析出固体；过滤 后得到的固体粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层无色（pH7. 0-8.0);最后，油状粗品用无 水乙醇重结晶纯化，-20°C冻干后得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯即DEP半抗 原中间体。
[0051] 将I. 5g(0. 0056mol)DEP半抗原中间体（4-硝基邻苯二甲酸二乙酯）装入容积为 500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入280mL(3. 1495mol)苯，待半抗原被苯 溶解后再加入3. 4g纯锌粉（0? 0520mol)，搅拌均匀后分次加入IOmL浓HCl(0? 1200mol)， 室温搅拌15min后再次加入3. 4g纯锌粉（0. 0520mol)，35°C搅拌反应IOh;反应结束后，将 340mL冷水加入反应体系，并用IM氢氧化钠溶液中和至弱碱性（pH7. 0-8. 5);静置Ih后分 离出苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，水洗后用无水Na2SOJ^水干燥，萃取液减压蒸馏 以除去苯，得到的浅黄色固体再用无水乙醇重结晶，硅胶柱层析（洗脱剂为，乙酸和正己烷 的混合液（V/V= 8:l))后减压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二乙酯，即DEP半 抗原。邻苯二甲酸二乙酯半抗原分子式=C12H15NO4;分子量237. 25 ;产率86. 2 %;恪点：90~ 92°C，纯度 98%。
[0052] (2)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的鉴定
[0053]将制得的半抗原经红外光谱（图1)、核磁共振光谱（图2)鉴定，红外光谱结果 为：IR(KBr)V/cm1Z3466. 06, 3369. 16 (-NH2)，1720. 18(C= 0)，1257. 81，1068. 87 (C-O-C)， 2980. 89, 2927. 48 (-CH3)，1449. 97 (d-0CH2-)，1630. 07, 1564. 19, 1449. 97(C=C)， 3227. 98, 1604. 33, 833. 75 (C-H,Ar)。核磁共振光谱结果为^HNMR(400MHz,CDC13): 8 7. 73 (d, 1H,ArH) , 6. 73 (d, 1H,ArH), 6. 67 (d, 1H,ArH), 4. 36 (q, 2H,OCH2), 4. 30 (q, 2H, OCH2)，4. 26(b, 2H, -NH2)，I. 39(t, 3H,OCH2)，I. 33(t, 3H, 0CH2)ppm。红外、核磁表征结果表明， DEP半抗原具有-NH2、-O-CH2CH3、苯环等基团的特征吸收峰，证明制备的DEP半抗原分子中 含有氨基官能团，最终实验中成功制备了DEP半抗原。
[0054] 从以上分析可知，所合成的产物为目标物。
[0055]实施例2、邻苯二甲酸二乙醅半抗原的制备与鉴宙
[0056] (1)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的制备
[0057] 取洁净的容积为IOOmL三口圆底烧瓶，向瓶底装入IOg(0. 0474mol) 4-硝基 邻苯二甲酸，随后缓慢加入13. 7mL(0. 2370mol)无水乙醇，边搅拌边加入I. 55mL浓 H2S04(0 . 0 2 8 5mol)催化，90°C搅拌回流，直至薄板层析法（TLC)检测原料点消失为止（显色 剂：丙酮溶剂中溶解少量的高锰酸钾；展开剂，正己烷：乙酸乙酯=5:1);搅拌回流8h后反 应完成；蒸馏除去未反应的乙醇和生成的水；此时将液体趁热倒入冰水中，析出固体；过滤 后得到的固体粗品用10%Na2CO3溶液洗涤至水层无色（pH7. 0-8. 0)。最后，油状粗品用无 水乙醇重结晶纯化，-20°C冻干后得浅黄色针状晶体4-硝基邻苯二甲酸二乙酯即DEP半抗 原中间体。
[0058] 将I. 5g(0. 0056mol)DEP半抗原中间体（4-硝基邻苯二甲酸二乙酯）装入容积为 500mL三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入288mL(3. 2480mol)苯，待半抗原被苯 溶解后再加入3. 3g纯锌粉（0. 0504mol)，搅拌均匀后分次加入IOmL浓HCl(0. 1232mol)， 室温搅拌15min后再次加入3. 3g纯锌粉（0. 0504mol)，30°C搅拌反应Ilh;反应结束后，将 330mL冷水加入反应体系，并用IM氢氧化钾溶液中和至弱碱性（pH7. 0-8. 5);静置Ih后分 离出苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，水洗后用无水Na2SOJ^水干燥，萃取液减压蒸馏 以除去苯，得到的浅黄色固体再用无水乙醇重结晶，硅胶柱层析（洗脱剂为，乙酸和正己烷 的混合液（V/V= 8:l))后减压蒸馏，得到淡黄色晶体4-氨基邻苯二甲酸二乙酯，即DEP半 抗原。邻苯二甲酸二乙酯半抗原分子式=C12H15NO4;分子量237. 25 ;产率87. 6%;恪点：90~ 92°C，纯度 98%。
[0059] (2)邻苯二甲酸二乙酯半抗原的鉴定
[0060] 将制得的半抗原经红外光谱（图1)、核磁共振光谱（图2)鉴定，红外光谱结果 为：IR(KBr)V/cm1Z3466. 06, 3369. 16 (-NH2)，1720. 18(C= 0)，1257. 81，1068. 87 (C-O-C)， 2980. 89, 2927. 48 (-CH3)，1449. 97 (d-0CH2-)，1630. 07, 1564. 19, 1449. 97(C=C)， 3227. 98, 1604. 33, 833. 75 (C-H,Ar)。核磁共振光谱结果为^HNMR(400MHz,CDC13): 8 7. 73 (d, 1H,ArH) , 6. 73 (d, 1H,ArH), 6. 67 (d, 1H,ArH), 4. 36 (q, 2H,OCH2), 4. 30 (q, 2H, OCH2)，4. 26(b, 2H, -NH2)，I. 39(t, 3H,OCH2)，I. 33(t, 3H, 0CH2)ppm。红外、核磁表征结果表明， DEP半抗原具有-NH2、-O-CH2CH3、苯环等基团的特征吸收峰，证明制备的DEP半抗原分子中 含有氨基官能团，最终实验中成功制备了DEP半抗原。
[0061] 从以上分析可知，所合成的产物为目标物。
[0062]实施例3、邻苯二甲酸二乙醅人工包被原的合成与鉴宙
[0063] (1)邻苯二甲酸二乙酯人工包被原的合成
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