管得到的Ct值分别计算变异系数，依次为0. 7 % (CP22. 59)、0. 76 (CP29. 27)、 0. 88% (CP35. 34)，变异系数均< 5%，说明该试剂盒的精密度检测符合要求。
[0085] 实施例4试剂盒的准确性及特异性
[0086] 采用中检所"HIV-1RNA国家标准品"中的阳性参考品为待检测样本，实验操作与实 施例1中描述一致，检测结果以每个"HIV-1RNA国家标准品"中的阳性参考品均可检出作为 检测该试剂盒准确性的指标，得到图4a。
[0087] 选取正常人血清（N)和其他血源性病原微生物，包括乙型肝炎病毒（HBV)，丙型 肝炎病毒（HCV)，丁型肝炎病毒（HDV)，戊型肝炎病毒（HEV)，EB病毒（EBV)，人巨细胞病毒 (HCMV)，梅毒螺旋体（TP)，经相应的试剂盒检测均呈阳性，并经测序验证为相应微生物。以 上述特异性标本作为待检样本，实验操作与实施例1中描述一致，检测结果以待检样本检 测均为阴性作为检测该试剂盒特异性的指标，得到图4b。
[0088] 检测结果如图4a和4b所示，图4a中显示检测的10份"HIV-1RNA国家标准品"中 的阳性参考品结果均为阳性，图4b中显示检测的8份HIV-I特异性样本检测均为阴性。
[0089] 由图4a和4b可以看出，该试剂盒具有较好的准确性和特异性。
[0090] 实施例5试剂盒的干扰实验
[0091] 为考察血浆或血清样本中可能存在的内源性物质对检测结果的影响，选取含高浓 度的胆红素（浓度超过20mg/mL)、甘油三酯（浓度超过3000mg/dL)、血红蛋白（浓度超过 6g/dL)和白蛋白（浓度超过1.0g/dL)的临床血浆样本和血清样本，但经检测均为HIV-I阴 性，使用正常人血浆和血清作为对照。在以上10份样本中分别加入相应的HIV-I阳性血浆 和血清，使其终浓度一致，未经处理的样本作为对照。采用实施例1中的反应体系和反应条 件同时检测以上的样品，检测结果用定量值对数的变异系数<5%作为检测该试剂盒内源 性干扰实验的指标。
[0092] 恩曲他滨、拉米夫定、齐多夫定、去羟肌苷、替诺福韦、依非韦仑、奈韦拉平、茚地那 韦目前被认为是治疗HIV-I感染疗效较肯定的药物，因此，在血清/血浆样本中存在以上 药物的可能性很大。为考察血清/血浆样本中可能存在的以上外源性物质对检测结果的 影响，依据药物的药峰浓度添加上述药物分别至确诊为的HIV-I阳性标本和HIV-I阴性标 本中进行检测，实验操作与实施例1中描述一致，检测结果以HIV-I阳性标本检测为阳性， HIV-I阴性标本检测为阴性作为检测该试剂盒外源性干扰的指标。
[0093] 内源性干扰试验的检测结果如表2中所示，在10份空白样本（其中含高浓度的胆 红素、甘油三酯、血红蛋白和白蛋白的血浆为一组，以正常的血浆为对照，共5份；含高浓度 的胆红素、甘油三酯、血红蛋白和白蛋白的血清为一组，以正常的血清为对照，共5份）中加 入相同浓度的HIV-I样本（病毒载量定量为I.OXIO3IUAiL)，分别计算两组检测结果的定 量值对数的变异系数，分别为3. 50%和1. 97%，均< 5%，说明该试剂盒检测HIV-I血清或 血浆样本时，如其中含有高浓度的胆红素、甘油三酯、血红蛋白和白蛋白等物质不干扰检测 结果。
[0094] 表2内源性干扰实验检测结果
[0095]
[0096] 注：1、含胆红素（浓度超过20mg/mL)的血浆；2、含甘油三酯（浓度超过3000mg/ dL)的血浆；3、含血红蛋白（浓度超过6g/dL)的血浆；4、含白蛋白（浓度超过1.0g/dL) 的血浆；5、正常人血浆；6、含胆红素（浓度超过20mg/mL)的血清；7、含甘油三酯（浓度超 过3000mg/dL)的血清；8、含血红蛋白（浓度超过6g/dL)的血清；9、含白蛋白（浓度超过 l.Og/dL)的血清；10、正常人血清。
[0097] 外源性干扰试验的检测结果如表3中所示，在确诊为HIV-I阳性的8份标本和确 诊为HIV-I阴性的8份标本中分别加入药峰浓度的恩曲他滨、拉米夫定、齐多夫定、去羟肌 苷、替诺福韦、依非韦仑、奈韦拉平、茚地那韦进行检测，结果8份HIV-I阳性标本检测为阳 性，8份HIV-I阴性标本检测为阴性，说明该试剂盒检测HIV-I血清或血浆样本时，如其中含 有恩曲他滨、拉米夫定、齐多夫定、去羟肌苷、替诺福韦、依非韦仑、奈韦拉平、茚地那韦等药 物时不干扰检测结果。
[0098] 表3外源性干扰实验检测结果
[0099]
[0101] 以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详 细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发 明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征在于，包括： 样本处理剂，包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、P -巯基乙醇和蛋白酶K ; 其中，P -巯基乙醇和异硫氰酸胍协同抑制RNase活性，异硫氰酸胍将RNase变性，暴露出 RNase活性中心的二硫键，P -巯基乙醇打开二硫键，从而抑制其活性； 用于靶核苷酸扩增的上游引物HIV-F ; 用于靶核苷酸扩增的下游引物HIV-R ; 用于靶核苷酸检测的Taqman探针HIV-P，所述Taqman探针HIV-P的两端分别结合有荧 光基团和荧光猝灭剂；以及 RNA -步法反应缓冲液。2. 根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征在于，所 述样本处理剂用于与检测样本混合均勾后在55°C~70°C加热IOmin~15min。3. 根据权利要求1或2所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征 在于，所述样本处理剂中，所述异硫氰酸胍的浓度为〇. 2mol/L~2mol/L，所述柠檬酸钠的 浓度为IOmmoVL~30mmol/L，所述十二烷基肌酸钠的质量百分含量为0. 2%~1%，所述 0 -疏基乙醇的浓度为〇? 05mol/L~0? lmol/L，所述蛋白酶K的浓度为lmg/mL~5mg/mL〇4. 根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征在于，所 述上游引物HIV-F的序列为SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的序列，所述下游引物HIV-R 的序列为 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 或 SEQ ID No. 6 所示的序列。5. 根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征在于，所 述Taqman探针HIV-P的序列为SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 8所示的序列。6. 根据权利要求1或5所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征 在于，所述Taqman探针HIV-P的5'端结合有FAM，所述Taqman探针HIV-P的3'端结合有 BHQl 07. 根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征在于，还 包括HIV-I内标的RNA转录物和内标探针HIV-IC，所述HIV-I内标的RNA转录物为HIV-I 内标转录得到，所述HIV-I内标为竞争性内标，所述内标探针HIV-IC的两端分别结合有荧 光基团和荧光猝灭剂。8. 根据权利要求7所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征在于，所 述HIV-I内标的序列为SEQ ID No. 9所示的序列。9. 根据权利要求7所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征在于， 所述内标探针HIV-IC的碱基序列序列为SEQ ID No. 10所示的序列，所述内标探针HIV-IC 的5'端结合有HEX，所述内标探针HIV-IC的3'端结合有BHQl。10. 根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，其特征在于， 还包括HIV-I定量参考品、HIV-I阳性对照和HIV-I阴性对照。
【专利摘要】本发明公开了一种人类免疫缺陷病毒HIV-1的定量检测试剂盒，包括：样本处理剂，包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、β-巯基乙醇和蛋白酶K；用于靶核苷酸扩增的上游引物HIV-F；用于靶核苷酸扩增的下游引物HIV-R；用于靶核苷酸检测的Taqman探针HIV-P，所述Taqman探针HIV-P的两端分别结合有荧光基团和荧光猝灭剂；以及RNA一步法反应缓冲液。这种人类免疫缺陷病毒HIV-1的定量检测试剂盒在进行检测时，直接将检测样本与样本处理剂混合处理后即可用于后续检测。相对于传统的HIV病毒的定量检测试剂盒，这种人类免疫缺陷病毒HIV-1的定量检测试剂盒省略了从样本中提取纯化的核酸分子的步骤，从而操作上更为省时、简单。
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105087826
【申请号】CN201510494301
【发明人】李泓彦, 邓艳华, 刘莉莉
【申请人】菲鹏生物股份有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月12日