SE
[0134] 表10:残余肾小鼠中的肾组织病理学评分（研究2)
[0135]
[0136] 表11:残余肾小鼠中的肾组织病理学评分（研究3)
[0137]
[0138] 实施例7:抗体III在糖尿病db/db小鼠和单侧肾切除db/db小鼠中减少白蛋白 尿并改善肾组织损害
[0139] 可以在糖尿病db/db和单侧肾切除db/db小鼠中体内测量VEGFRl抗体改善白蛋 白尿和肾组织学损害（二种CKD指标）的潜力。db/db小鼠代表一种形成与人糖尿病性肾 病相似的白蛋白尿和肾组织病理损害的2型糖尿病小鼠模型（Sharma等人，（2003)AmJ PhysiolRenalPhysiol284:F1138)。单侧肾切除的db/db小鼠比未接受单侧肾切除术的 db/db小鼠形成更多白蛋白尿和更严重的肾结构损害（Ninichuk等人，（2007)EurJMed Resl2 ：351)〇
[0140] 对于尿采集和尿白蛋白及肌酸酐测量，可以通过在96孔Corning#3359聚丙烯微 量滴定板上放置单只动物，采集随机尿。可以将有机玻璃容纳室固定在小鼠和平板上方。 可以使用微量移液器，将尿转移至冰上的I. 5mL微量离心管中，并以10, 000转/分钟离心 5分钟。尿白蛋白可以使用内部验证的测定法测量，并且尿肌酸酐可以使用酶促法测量。
[0141] 对于肾病理学，可以在研究结束时采集肾，在福尔马林中固定，并根据标准方法加 工成石蜡切片。可以由病理学家评价肾切片的肾损害。可以使用以下量度半定量评定肾小 球膜基质、肾小球纤维化和间质纤维化：无（〇)，最少（1)，轻微（2)，中等（3)，明显（4)和严 重（5)。可以使用H&E和PAS染色的切片评定肾小球膜基质扩张和基底膜增厚。可以评价 Masson三色染色的肾切片以确定（间质和肾小球）纤维化程度。
[0142] 数据可以展示为均数+/-SE。GraphPadPrism或JMP可以用于ANOVA分析，随后 用于Dunnett多重比较检验。可以将小于0. 05的P值视为统计显著。
[0143] 在基本上如实施例7中所述那样进行的实验中，进行了 2项研究。在研究4中，雄 性db/db雄性小鼠（BKS.Cg-+L印rdb/+L印rdb/01aHsd)购自Harlan实验室（印第安纳波 利斯，IN)，并且在7周龄随机分配以每周三次（tiw)分别接受PBS、10mg/kg对照大鼠IgGU l〇mg/kg抗体III和3mg/kg抗体III，持续六周。每个组中的小鼠数是10，例外是具有8只 小鼠的PBS组。在处理的第4和第6周采集的随机尿中测定白蛋白/肌酸酐（ACR)。在六 周研究结束时检查血液参数和肾组织学。
[0144] 在研究5中，根据IACUC及其机构指南在4周龄的db/db小鼠（BKS.Cg-+L印r db/+L印rdb/OlaHsd)中实施单侧肾切除术。小鼠在大约8-9周龄随机分配。本研究中包 括 7 个组：（I)PBS对照，n= 6 ; (2)大鼠IgGl，30mg/kg，每周二次，n= 10 ;⑶抗体III， 30mg/kg，每周二次，n= 10 ;⑷抗体III，10mg/kg，每周三次，n= 10 ; (5)抗体III，IOmg/ kg，每周一次，n= 10 ; (6)抗体III，3mg/kg，每周一次，n= 10 ;和（7)抗体III，lmg/kg，每 周一次，n= 10。动物按0. 2mL/注射皮下（sc)给药6周。如表13和表15中所示定期检 查血糖、体重、随机尿ACR。在六周研究结束时检查血液肌酸酐、BUN和肾组织学。
[0145] 在研究4和5中，对于db/db小鼠中10mg/kg每周三次和3mg/kg每周三次的剂 量和单侧肾切除db/db小鼠中全部测试的剂量（30mg/kg，每周三次；10mg/kg，每周三次； 10mg/kg，每周一次；3mg/kg每周三次；3mg/kg，每周一次，和lmg/kg，每周一次），与对照抗 体相比，抗体III显著减少尿白蛋白/肌酸酐（ACR)(表12-13)。在单侧肾切除db/db小鼠 中，抗体III还改善肾组织病理学评分，如通过肾小球膜基质评分所测量，并减少血尿素氮 (BUN)(表 14 和表 15)。
[0146] 表12 :抗体III减少db/db小鼠中的ACR(研究4)
[0147]
[0148] 表13 :抗体III减少单侧肾切除db/db小鼠中的ACR(研究5)
[0149]
[0154] 实施例8 :抗体IV在糖尿病db/db-eNOS缺陷小鼠中减少白蛋白尿、阻止血清肌酸 酐增加并降低死亡率
[0155] 可以在糖尿病db/db-eNOS缺陷小鼠中体内测量VEGFRl抗体改善白蛋白尿和肾功 能（二种CKD指标）的潜力。db/db-eNOS敲除小鼠代表一种与更晚期阶段的人糖尿病性肾 病相似的糖尿病肾损伤模型。这些小鼠形成高血糖、白蛋白尿、小动脉玻璃样变性、GBM变 厚、肾小球膜扩张、肾小球膜溶解、局灶性节段性和早期结节性肾小球硬化、以及肾小球滤 过率（GFR)下降（Zhao等人，（2006)JAmSocNephrol17:2664)。不作处理情况下，小鼠 在16-20周龄后显示高死亡率。
[0156] 对于尿采集和尿白蛋白及肌酸酐测量，可以通过在96孔Corning#3359聚丙稀微 量滴定板上放置单只动物，采集随机尿。可以将有机玻璃容纳室固定在小鼠和平板上方。 可以使用微量移液器，将尿转移至冰上的I. 5mL微量离心管中，并以10, 000转/分钟离心 5分钟。尿白蛋白可以使用内部验证的测定法测量，并且尿肌酸酐可以使用酶促法测量。
[0157] 在基本上如实施例8中所述那样进行的实验中，检验抗体IV功效的两项研究在糖 尿病db/db-eNOS敲除小鼠中实施（研究6和研究7)。
[0158]对于研究 6，db/db-eNOS敲除小鼠（BKS.Cg-Lepr〈db>-Nos3〈tmlUnc/Rhrs>)在 8 至22周龄随机分配至两个组中：由接受10mg/kg小鼠IgGl的6只雄性和5只雌性小鼠组 成的对照组和由接受l〇mg/kg抗体IV的6只雄性和4只雌性小鼠组成的处理组。将抗体 按体积〇.2mL/注射每周三次（tiw)皮下（sc)施用12周。在研究结束时测量血清肌酸酐。
[0159] 对于研究7,将db/db-eNOS敲除小鼠随机分配入三个组以分别接受PBS、10mg/kg 的对照小鼠IgGl和10mg/kg的抗体IV。PBS组由11只小鼠（包括5只雄性小鼠和6只雌 性小鼠）组成。对照IgGl组由11只小鼠（包括6只雄性小鼠和5只雌性小鼠）组成。处 理开始时，抗体IV组由7只雄性小鼠和5只雌性小鼠组成。将抗体IV试剂和对照试剂每 周三次（tiw)皮下施用12周。在基线和处理的第2、4、6、6、10,和12周测量随机尿ACR水 平。在基线和处理的第6周和第12周检查血清肌酸酐。
[0160] 在db/db-eNOS敲除小鼠中，与相应时间点处的对照相比，抗体IV显著减少白蛋白 尿，如通过尿白蛋白/肌酸酐（ACR)所测量（表16)。抗体IV还改善糖尿病db/db-eNOS敲 除小鼠中的肾功能，如通过阻止血清肌酸酐升高所测量（表16)。在研究终点时存活的小 鼠当中，对照组（PBS+IgGl，n= 13)中的69%血清肌酸酐升高大于50%，相比之下抗体IV 组（n= 10 ;卡方检验中P= 0. 016) 10%血清肌酸酐升高大于50%。另外，对照组中30% 小鼠的血清肌酸酐加倍，而抗体IV组中小鼠的血清肌酸酐均不加倍。抗体IV处理在db/ db-eNOS敲除小鼠中降低了死亡率（表17)。
[0161] 表16 :抗体IV减少糖尿病db/db-eNOS缺陷小鼠中的ACR
[0162]
[0163] 表17:抗体IV处理和对照抗体处理的糖尿病db/db-eNOS敲除小鼠中的存活率 (% )(研究6和7)
[0164]
[0165] 实施例9:抗体II和III对猴和小鼠中的血液PlGF水平的作用
[0166] 可以在猴和小鼠中测量VEGFRl抗体影响体内血液PlGF水平的能力。为了测量 猴血浆中的P1GF，可以使用PlGFELISA测定（R&DSystems#DPG00)。为了测量小鼠血液 中的P1GF，可以使用PlGFELISA测定（R&DSystems，Quantikine小鼠P1GF-2免疫测定法； 目录号MP200)。在分析之前，可以将血清和血浆样品按2-20倍稀释入校准物稀释剂（R&D Systems#RD5_17)。对于小鼠P1GF，标准曲线可以是23. 4pg/ml至1500pg/ml，并且对于猴 P1GF，是 15. 6pg/ml至 1000pg/ml。数据可以表示为均数+/-SE;并且GraphPadPrism4 可 以用于数据分析。
[0167] 在食蟹猴研究中，可以使用从4组在2. 5-4. 5岁的猴（每个组由4只雄性和4只 雌性猴组成）采集的血浆测量血液PlGF对抗体II的体内反应。这些猴可以按0、3、20或 65mg/kg的剂量每周一次（qw)接受抗体II持续13周。血液样品可以在研究结束时采集。
[0168] 在小鼠研究中，可以使用从残余物小鼠或单侧肾切除db/db小鼠中采集的血液测 量血液PlGF对抗体III的体内反应。在残余肾小鼠研究中，抗体III可以按10mg/kg和 3mg/kg，1周3次（tiw)给药8周。在单侧肾切除db/db研究中，抗体III可以30mg/kg每 周二次、10mg/kg每周二次、10mg/kg每周一次、3mg/kg每周一次和lmg/kg每周一次施用6 周。血浆样品可以在研究结束时采集。
[0169] 在基本上如实施例9中所述那样进行的实验中，在3、20和65mg/kg的剂量每周一 次持续13周时，抗体II显著地升高食蟹猴中的血浆PlGF水平（表18)。抗体III在残余 肾小鼠和单侧肾切除小鼠中均剂量依赖地升高血液PlGF(表19)。
[0170] 表18 :在抗体II处理13周的食蟹猴中的血液PlGF
[0175] P<0. 01
[0176] 实施例10 :小鼠和猴肾中的肾VEGFR2磷酸化
[0177] 可以在猴和小鼠的肾中测量VEGFRl抗体影响肾VEGFR2磷酸化的能力。
[0178] 猴肾可以从食蟹猴研究采集，其中4组在2. 5-4. 5岁的猴（每个组由4只雄性和 4只雌性猴组成）可以每周一次（qw)用抗体II分别按0、3、20和65mg/kg的剂量处理13 周。剂量0组中的猴可以接受溶媒（PBS，pH7.4)注射。可以在研究结束时采集和冷冻肾 脏样品。
[0179] 可以使用QIAGENTissueLyser制备猴肾匀浆，其中可以将大约150yg猴肾组织 置于冰上的2mlQIAGEN管中并且随后添加500yL样品缓冲液（MSDphosphor-VEGFR2,目 录号K151DJD-1)。该管可以在QIAGENTissueLyser上随不锈钢珠（5mm，QIAGEN#69989) - 起以6. 5速度振摇60秒。该管可以在冰上温育5分钟，随后在4°C转动该管30分钟。随后 可以将该管在4°C和8, 000转/分钟离心10分钟。可以将上清液移出到一个新的微量离心 管。可以使用BCA测定法（PierceBCA蛋白质测定试剂盒，目录号23227)确定1:100稀释 的匀浆中的蛋白质浓度。样品可以贮存在_80°C.
[0180] 可以使用Phospho-VBGFR-2 (TyrKM)测定全细胞裂解物试剂盒（MSD#K151DJIK)，确定磷 酸化的VEGFR2 7K平。可以将含有400yg总蛋白的猴肾匀浆上样至IJ每个孔。
[0181] 可以从如实施例6中所述的残余肾研究、如实施例7中所述的单侧肾切除db/db 小鼠研究或在129只正常小鼠中采集小鼠肾。在129只小鼠研究中，来自TaconicFarm的 129只雄性S6/SvEvTac小鼠可以在大约10周龄随机分配入两个组，以接受抗体III或对照 大鼠IgGl抗体。抗体III和对照IgGl抗体可以按10mg/kg每周三次（tiw)皮下施用16 周。可以在16周研究结束时采集肾脏。
[0182] 可以通过添加大约50yg小鼠肾至300yL样品缓冲液(MSD小鼠phospho.R(Tyrll75)，制 备小鼠肾匀浆。可以将管置于冰上并在FastPr印上以6. 5速度振摇40秒。在冰上温育5 分钟后，可以使用FastPrep破碎组织。可以将管在4°C转动30分钟，随后在4°C和8, 000转 /分钟离心10分钟。可以将上清液移出到一个新的微量离心管。可以使用BCA法（Pierce BCA蛋白质测定试剂盒，目录号23227)确定1:100稀释的匀浆中的蛋白质浓度。样品可以 贮存在-80°C.
[0183] 可以使用小鼠phosph〇-KDR(Tyrll75)测定全细胞裂解物试剂盒（MSD订购号 N45CA-1)，确定磷酸化的小鼠VEGFR2。可以将含有400yg总蛋白的小鼠肾匀浆上样到每个 孔。可以使用SECTOR成像仪读取0D。
[0184] 在基本上如实施例10中所述那样进行的实验中，抗体II在每周一次接受20mg/kg 剂量持续13周的食蟹猴中增加肾VEGFR2磷酸化（表20)。类似地，在接受六周抗体III处 理的残余肾小鼠中（表21)、在接受6周抗体III处理的单侧肾切除db/db小鼠中（表22) 以及在接受16周抗体III处理的129只小鼠中（表23)，抗体III增加肾VEGFR2磷酸化。
[0185] 表20 :在抗体II处理后的猴肾中的VEGFR2磷酸化
[0186]
[0187]
[0188] P<0. 05
[0189] 表21:抗体III增加残余物小鼠肾中的肾VEGFR2磷酸化。
[0190]
[0191] P〈0. 003,vs.rlgGl对照组，通过ANOVA和Dunnett比较
[0192