[0044]
[0045] 实验结果见图1。在细胞密度分别为15600个/cm2、19000个/cm2、22000个/ cm2和25000个/cm2,细胞存活率为85 %的条件下，SDS溶液在处理体系中的浓度分别为 0? 432yg/ml、0? 357yg/ml、0? 96yg/ml、0? 286yg/ml。综合考虑SDS在处理体系中的浓度 较低且细胞铺板密度较低两个因素，确定人表皮角质细胞的最佳接种细胞密度为19000个 /cm2,SDS在处理体系中的浓度为0. 357yg/ml。
[0046]实施例2、处理时间的优化
[0047] 进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
[0048] 1、将实施例1制备的细胞悬浮液2接种于6孔板，37°C、5%C02环境中培养24h(实 际应用中18h-26h均可）。
[0049]2、用DMEM培养基溶解SDS，获得SDS溶液。
[0050] 3、取6孔板：向6孔板中的第一个孔中加入SDS溶液，使处理体系中的SDS浓度为 0. 357yg/ml(实际应用中0. 3-0. 4yg/ml均可），5%C02、37°C培养lh，吸弃上层培养基，加 适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞A;向6孔板中的第二个孔中加入SDS溶 液，使处理体系中的SDS浓度为0. 357yg/ml(实际应用中0. 3-0. 4yg/ml均可），5 %C02、 37 °C培养2h，吸弃上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞B;向6 孔板中的第三个孔中加入SDS溶液，使处理体系中的SDS浓度为0. 357yg/ml(实际应用中 0. 3-0. 4yg/ml均可），5%C02、37°C培养4h，吸弃上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸 弃，收取细胞，命名为细胞C;向6孔板中的第四个孔中加入SDS溶液，使处理体系中的SDS 浓度为〇. 357yg/ml(实际应用中0. 3-0. 4yg/ml均可），5 %C02、37°C培养6h(实际应用 中5-7h均可），离心，去上层培养基，加适量PBS缓冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞 D;向6孔板中的第五个孔中加入SDS溶液，使处理体系中的SDS浓度为0. 357yg/ml(实际 应用中0. 3-0. 4yg/ml均可），5%C02、37°C培养8h，吸弃上层培养基，加适量PBS缓冲液洗 涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞E;将六孔板中的第六个孔，吸弃上层培养基，加适量PBS缓 冲液洗涤，吸弃，收取细胞，命名为细胞F。
[0051] 4、用Eastep TM总RNA提取试剂盒（普洛麦格（北京）生物技术有限公司产品， 产品目录号为CAT#LS1030)提取细胞（细胞A、细胞B、细胞C、细胞D、细胞E或细胞F)的 总RNA，提取步骤按试剂盒自带说明书进行。
[0052] 5、将步骤4获得的总RNA用FastQuantRTKit(WithgDNase)(天根生化科技（北 京）有限公司产品，产品目录号为KR106-01)进行cDNA第一条链合成反应，得到cDNA，向上 述cDNA加入ddH20稀释，得到cDNA浓度为lOOOng/yL的模板溶液。
[0053] 6、荧光定量PCR扩增：
[0054] 以步骤5得到的模板溶液为模板，通过荧光定量PCR检测细胞中炎症因子IL-1a 的相对表达量（以GADPH基因为内参基因）。炎症因子IL-1a的基因序列如序列表中序列 1所示。
[0055]鉴定炎症因子IL-1a的引物为 5' -AGTAGCAACCAACGGGAAGG-3' 和 5'-AAGGTGCTG ACCTAGGCTTG-3'，目的片段如序列表中序列1自5'末端第1179位至第1306位所示。
[0056]内参为管家基因GADPH，内参的引物为actin-F:5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' 和 actin-R:5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
[0057]其中焚光定量PCR上样体系按照OneStepSYBR?PrimeScript?RT-PCRKit II(PerfectRealTime) (TaKaRa公司产品）的说明书上样，反应体系为共20yl，10.0yl MIX、0.4ylDyeII、0.5yl正向引物（含5ng引物）、0.5yl反向引物（含5ng引物）、lyl 模板溶液和7. 6y1ddH20。
[0058] 将细胞F中炎症因子IL-1a的相对表达量作为1，各个细胞（细胞A、细胞B、细胞 C、细胞D或细胞E)中炎症因子IL-1a的相对表达量见图2。
[0059] 细胞A、细胞B、细胞C、细胞D和细胞E中炎症因子IL-la的表达量分别为细胞F 中炎症因子IL-1a的表达量的〇. 89倍、0. 96倍、0. 92倍、1. 19倍和1. 13倍。可见，SDS的 最佳处理时间为6h。
[0060] 结果表明，提高人表皮角质细胞中炎症因子IL-1a的表达量的最佳条件为：接种 细胞密度19000个/cm2、SDS在处理体系中的浓度为0. 357yg/ml和处理时间6h。
【主权项】
1. 一种促进离体的人角质细胞表达炎症因子IL-I a的方法，包括如下步骤a2):用 SDS处理离体的人角质细胞。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤a2)中，用浓度为0. 3-0. 4 y g/ml 的SDS处理所述离体的人角质细胞。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤a2)中，用浓度为0. 357 y g/ml的 SDS处理所述离体的人角质细胞。4. 如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤a2)中，用SDS处理离 体的人角质细胞的条件参数为：35-39°C，5h-7h。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述条件参数为37°C和6h。6. 如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤al): 将离体的人角质细胞的细胞悬液接种至细胞培养板，培养； 在进行所述步骤a2)前先进行所述步骤al)。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤a2)为：完成步骤al)后，取所述 细胞培养板，加入SDS溶液并培养。8. 如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述步骤al)中，所述细胞悬液中人角 质细胞的浓度为18000-20000个/cm 2。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述细胞悬液中人角质细胞的浓度为19000 个 /cm2 〇10. 如权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于：所述炎症因子IL-I a的基因 序列如序列表中序列1所示。
【专利摘要】本发明公开了一种促进离体的人角质细胞表达炎症因子IL-1α的方法，包括步骤a2)：用SDS处理离体的人角质细胞。所述步骤a2)中，用浓度为0.357μg/ml的SDS处理所述离体的人角质细胞；用SDS处理离体的人角质细胞的条件参数为37℃，6h。所述方法还包括如下步骤a1)：将离体的人角质细胞的细胞悬液接种至细胞培养板，培养；在进行所述步骤a2)前先进行所述步骤a1)。所述步骤a1)中，所述细胞悬液中的细胞浓度为19000个/cm2；培养条件为37℃和24h。实验证明，本发明提供的方法可以显著促进人表皮角质细胞中炎症因子IL-1α的表达，从而可以用于筛选治疗炎症的药物。
【IPC分类】C12N5/071, C07K14/545
【公开号】CN105111300
【申请号】CN201510531599
【发明人】苏宁, 郑洪艳, 杨丽, 刘娟, 赵丹, 霍彤, 王昌涛
【申请人】中国检验检疫科学研究院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月26日