萝卜种子中莱菔素的提取和分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及莱廉素提取和纯化技术，具体设及萝h种子中莱廉素的提取和分离纯 化方法。
【背景技术】
[0002] 流行病学研究表明，经常食用十字花科植物，如萝K西兰花、白菜、花菜等，可W 降低患癌症和屯、血管疾病的风险，与运些植物中富含硫巧、多酪有很大关。植物中的硫巧存 在于植物细胞的液泡中，相对比较稳定，植物被研磨或切碎时，硫巧就会与硫巧酶接触，发 生酶解反应，生成异硫氯酸醋、硫氯酸醋、腊等反应产物。异硫氯酸醋具有很高的生物学活 性，能够有效地防止饮食中多种致癌物包括多环芳控、杂环胺和亚硝胺所引起的DNA损伤 和癌症，还具有杀菌、抑制血小板聚集等作用。许多研究表明，西兰花中的莱廉硫烧是最重 要的抗癌物质之一。
[0003] 莱廉素是目前蔬菜中发现的抗癌活性最强的植物活性成分。主要存在于十字花科 植物萝h的干燥成熟的种子中。生物实验证明，莱廉素具有抗肿瘤、解毒抗菌、抗氧化的作 用，对肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前胃癌有明显的阻断作用。近些年来，存在于萝h种子中 的莱廉素的生物活性逐渐被人们重视。莱廉素，又称萝h子素，在萝h种子中含量丰富，能 有效抑制癌细胞的生长，诱导白血病癌细胞的死亡，莱廉素与莱廉硫烧相比，在控基链上有 不饱和键，被发现比莱廉硫烧的活性强1. 3 - 1. 5倍，它可能成为今后保健品及医药领域研 究和开发的又一新方向。
[0004] 现有技术中，针对莱廉素的提取存在提取工艺复杂，W及提取纯度过低等问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了萝h种子中莱廉素的提取和分离纯化方 法。研究了萝h种子中莱廉素的提取及薄层层析分离纯化方法，为萝h种子中的莱廉素的 开发利用提供依据。
[0006] 本发明的进一步改进包括：萝h种子中莱廉素的提取方法，依次包括W下步骤： 选取萝h种子，冷冻干燥，粉碎，萝h种子脱脂，残渣酶解，溶剂提取和旋转蒸发后得到莱廉 素粗提物。
[0007] 本发明的进一步改进包括：
[0008] 所述的萝h种子脱脂是将冷冻干燥的萝h种子用药物粉碎机粉碎，采用索氏提取 法，乙酸为溶剂抽提萝h种子中的油脂，脱脂残渣备用。
[0009] 所述的脱脂残渣加1倍量蒸馈水，调节酶解体系抑3-7,封口，摇床中酶解0. 5-化。
[0010] 所述溶剂提取包括：于酶解产物内加20倍二氯甲烧，封口，在20-25°C，250r/min 环境下摇床5min，lOOOOr/min冷冻离屯、5min，取二氯甲烧层，相同方法再提取2次，合并S 次提取液，旋转蒸发，浓缩液体至原残渣质量的20倍体积，保存于-20°C环境下。
[0011] 所述的酶解时间为比，酶解溫度25°C，酶解PH值7。
[0012] 所述的溶剂提取中的提取溶剂为=氯甲烧或二氯甲烧。
[0013] 所述的溶剂提取时间为3-lOmin，固液比为1:20-40,提取溫度20-30°C。
[0014] 本发明的另一目的在于提供分离纯上述任一项所述方法制得的莱廉素粗提物的 方法，用硅胶G做固定化二氯甲烧、立氯甲烧、W体积比8:2的正己烧-乙醇混合液或W体 积比8:2:0. 5的正己烧-乙醇-水混合液为流动相，TLC分离纯化莱廉素粗提物。
[0015] 本发明的还提供了按照上述提取和纯化方法得到的莱廉素。
[0016] 本发明提取工艺简单，提取纯度高，通过进一步的纯化能够得到莱廉素的纯可达 到98. 9%
【附图说明】
[0017] 图1是酶解时间对莱廉素含量的影响。
[0018] 图2是酶解溫度对莱廉素含量的影响。
[0019] 图3是酶解PH值对莱廉素含量的影响。
[0020] 图4是提取时间对莱廉素含量的影响。
[0021] 图5是固液比对莱廉素含量的影响。
[0022] 图6是提取溫度对莱廉素含量的影响。
[0023] 图7是W体积比正8:2的己烧-乙醇混合液层析分离得到的莱廉素气相色谱图。
[0024] 图8是W体积比正8:2 :0. 5的正己烧-乙醇-水混合液层析分离得到的莱廉素气 相色谱图。
【具体实施方式】
[00巧]下面实施例对本发明做详细说明。 阳0%] 1材料与仪器
[0027]白萝h种子，韩国种子公司；莱廉素标品，Sigma公司；憐酸二氨钢、巧樣酸、二氯 甲烧和其他试剂均为国产分析纯试剂。 W28] 冷冻离屯、机：上海医分仪器制造有限公司）；TraceDSQ气质联用仪：美国 Finnigan公司）；RE-5299旋转蒸发仪：河南智诚科技发展有限公司；药物粉碎机：武义县 脸立工具有限公司。
[0029] 2实验方法
[0030]2. 1莱廉素提取工艺流程
[0031] 萝h种子一冷冻干燥一粉碎一脱脂一残渣酶解一溶剂提取一旋转蒸发一莱廉素 粗提物
[0032] 2. 2萝h种子脱脂方法
[0033] 冷冻干燥的萝h种子，用药物粉碎机粉碎，采用索氏提取法，乙酸为溶剂抽提萝h 种子中的油脂，计算种子油脂含量，残渣备用。
[0034] 2. 3脱脂残渣酶解方法
[0035] 2. 3. 1单因素试验
[0036] 脱脂残渣加1倍量蒸馈水，调节不同的酶解体系抑，封口，不同溫度的摇床中 分别酶解不同的时间，加20倍二氯甲烧，封口，摇床（25°C，250;r/min) 5min，冷冻离屯、 5min(l〇〇(K)r/min)，取二氯甲烧层。相同方法再提取2次，合并S次提取液，旋转蒸发，浓缩 液体至原残渣质量的20倍体积，保存于-20°C，用于测定莱廉素含量。
[0037] 2. 3. 2脱脂残渣酶解正交试验
[0038] 在单因素试验的基础上，W主要影响酶解条件的时间、溫度、抑为因素，采用S因 素=水平正交试验，优化脱脂残渣酶解条件。
[0039] 2. 4莱廉素提取方法
[0040] 2. 4. 1莱廉素提取单因素试验
[0041] 选择不同的溶剂、液固比、提取时间及溫度提取酶解后残渣中的莱廉素，保存 于-20°C，用于测定莱廉素含量。
[0042] 2. 4. 2莱廉素提取试验设计
[0043] 在单因素试验的基础上，W液固比，提取时间、溫度为因素，采用=因素=水平正 交试验，优化莱廉素提取条件。
[0044] 2. 4. 4验证试验
[0045] 在优化的酶解条件及提取条件下提取残渣中的莱廉素，用于薄层分离，并按下公 式计算提取萝h种子中莱廉素的产率。
[0046] 莱廉素产率％ =残渣中莱廉素的含量X(1-种子油脂含量％ )
[0047] 2. 5莱廉素TLC分离纯化
[0048]2. 5. 1薄层板的制备 W例采用湿法制板，硅胶G厚度0. 5mm，室溫惊干，于105°C的烘箱中活化比，干燥器中 保存备用。
[0050] 2. 5. 2最佳展开剂选择
[0051] 距离薄层边缘1cm处，用移液枪点样10^以冷风吹干，选用不同的展开剂分离提 取液中的物质，取出薄层板，电吹风冷风吹干后放入舰蒸汽中显色。观察色斑分离情况，W 分离的斑点多且好、不拖尾的展开剂为最佳展开剂。
[0052] 2. 5. 2莱廉素单体制备
[0053] 制备0. 5mm厚的20cmX20cm大小的硅胶薄板20块，用移液枪在薄板上成直线拉 点点样，每次10yL。将点样板展层，小屯、刮下含莱廉素的色带（对照标品显色薄板），并用 二氯甲烧溶解，冷冻离屯、，取上清液，用于莱廉素的鉴定与分析。
[0054] 2. 5. 3莱廉素的鉴定与纯度分析
[0055] 参考文献（具体文献名称是什么）的方法鉴定与测定莱廉素含量及纯度。
[0056]3结果与分析
[0057] 3.1萝h种子中油脂含量
[0058] 采用抽脂后恒重残渣的方法计算萝h种子中油脂的含量，平均结果为33. 1%。
[0059] 3. 2残渣酶解试验
[0060] 3. 2. 1单因素试验
[0061]3. 2. 1. 1酶解时间对莱廉素含量的影响 阳06引脱脂残渣加1倍量蒸馈水，封口，摇床（25°C，lOOr/min)中分别酶解O-lOh，取出， 加 20 倍二氯甲烧，封口，摇床（25°C，250r/min) 5min，冷冻离屯、5min(lOOOOr/min)，取二氯 甲烧层。其余操作同2. 3.1。试验结果见图1。可W看出，随酶解时间的延长，莱廉素含量 逐渐增加，但酶解时间超过比，莱廉素的量反而逐渐减少，最高含量的酶解时间是比。其中 的原因应该是Ih酶解过程已经完成，所W莱廉素含量最高；随着放置时间的延长，由于莱 廉素热稳定性差，且具有挥发性，使得莱廉素的含量逐渐减少。结果见图1.
[0063] 3. 2. 1. 2酶解溫度对莱廉素含量的影响
[0064] 在20~60°C下酶解比提取莱廉素。其余操作同2. 3. 1。绝大多数植物中酶的活 性溫度在50~60°C，但由图2知，25°C提取的莱廉素含量最高。其中的原因可能是25°C是 黑芥子酶最佳的活性溫度，或者黑芥子酶活性溫度接近50~60°C，但由于莱廉素的稳定性 差，致使提取率低。结果见图2. W65] 3. 2. 1. 3酶解抑对莱廉素含量的影响
[0066] 用憐酸-巧樣酸缓