. 0中配制），10μL的150mM熊去氧胆 酸，100μL稀释的酶液，在340nm处测定吸光值增加或者减少，酶活性单位（单位/mL)计 算公式为：[ΛA340/分钟X3 (mL)X粗酶稀释倍数]/ [6. 22X0. 1 (mL)]。
[0023] 2、制备和筛选RUHSDH随机突变文库获得高活性突变子
[0024] 使用易错PCR法来产生RUHSDH随机突变子。PCR反应物中额外添加了 0. 8-1.OmM 的dCTP+dTTP和5. 5-8.OmM的MgCl2来增加易错率，具体方法来源于（FrancesΗ·Arnold 的GeneratingMutantLibrariesUsingError-PronePCR(DirectedEvolutionLibrary Creationin"MethodsinMolecularBiology'，，Volume31，P3,HumanaPress) 〇
[0025] 将易错PCR产物插入到表达载体pET21a(+)的Ndel和Hindlll位点，并以电转 化法转入BL21(DE3)后在LB平板（100μg/mL氨苄）上得到随机突变子文库。将得到的 单菌落接种到2mL96深孔板中，每孔含200μLLB培养基（100μg/mL氨苄），对照为含有 野生型RUHSDH重组DNA的重组菌。在30~37°C，300~400转/分和80 %湿度下过夜培 养后，加入400μLLB培养基（100μg/mL氨苄）继续在30-37 °C下振荡培养2~4小时。 加入终浓度为0. 1~0. 2mM的IPTG后，在25~30°C下诱导3~5小时。取50μL菌液 于96微孔板里制备甘油保存液-80°C保存，剩余部分离心收集细胞。每孔加入100μL的 lXbugbuster(71456-3CN,EMDMillipore)溶液后在常温下振荡裂解30分钟。加入50mM 磷酸钾缓冲液（pH8. 0)稀释2~10倍后再离心得到裂解酶液。在96微孔板上上依次加入 140μL0. 2mMNADPH(50mM磷酸钾缓冲液，pH8. 0中配制），10μL上述裂解酶液和50μL 15mM的7-KLCA溶液，使用酶标仪在340nm处测定吸光值的下降（单位时间内吸光值下降多 的代表活性高）。通过两轮筛选得到两个活性明显提高的突变子RU_8C2(SeqIDN0:3and4)和突变子RU-4F9(SeqIDNO: 5and6)。突变子在LB平板（100μg/mL氨苄）上划线纯 化并测序，按上述的野生型粗酶液的制备方法制备摇瓶发酵液和突变子粗酶液，用于活性 测定和比较。
[0026] 表一RUHSDH高效突变子的氨基酸残基变化及摇瓶发酵活性比较
[0027]
[0028] 3、重组7β-类固醇脱氢酶及其突变子的高密度发酵生产
[0029] 将平板上单菌落接种到250~500mLLB培养基（100μg/mL氨苄）中，在30~ 37°C下振荡培养12~16小时。由此方法得到的种子液以5~10%的量接种到5L的起始 培养基中，起始培养基含有：15~30g/L的甘油，25~30g/L的磷酸二氢钾，10~15g/ L的硫酸胺，5-10g/L的七水硫酸镁，0. 2~0. 5g/L的七水硫酸铁。重组大肠杆菌在10L 发酵罐里进行通气搅拌培养，温度30~37°C，pH6. 0~7. 0,调节搅拌和通气控制溶氧在 15-30%。待起始培养基里的甘油耗尽后，开始流加诱导培养基（乳糖：40~50g/L，甘油： 200-250g/L)诱导酶的产生。流加速度逐步增加，范围为60-250mL/小时。温度30~37°C， pH6. 0~7. 0,调节搅拌和通气控制溶氧在15-30%，总的诱导时间为8-12小时，直至细胞 湿重达到100g/L以上。离心收集细胞，将收集到的细胞悬浮于同体积发酵液的100mM的磷 酸缓冲液（pH8.0)中并超声破碎，离心后得到重组酶液后用于酶活测定和UDCA合成。
[0030] 表二RUHSDH突变子的发酵罐酶活性比较
[0033] 4、用于催化辅酶再生的醇脱氢酶的发酵和酶液制备
[0034] 将密码子优化的来源于Lactobacilluskefir(高加索酸奶乳杆菌）的醇脱氢 酶（alcoholdehydrogenase，ADH)合成基因（合成基因序列：SeqIDN0:7,编码蛋白 序列：SeqIDN0:8)插入到表达载体pET21a⑴的Ndel和Hindlll位点得到重组DNA pET21a(+) -LKDH。经过测序验证后，此重组DNA转入大肠杆菌宿主BL21 (DE3)得到重组大 肠杆菌。按照前面描述的方法进行摇瓶发酵验证和发酵罐高密度发酵生产，并用收集的细 胞进行超声破碎得到醇脱氢酶（30~40单位/mL)，从而用于酶活测定和UDCA合成过程中 的辅酶再生。醇脱氢酶酶活测定方法见US8257952。
[0035] 5、熊去氧胆酸的酶法合成、提取和精制
[0036] 将7-KLCA悬浮在15~25 %反应体积的50mM磷酸钾缓冲液（pH8. 0)中，用2N NaOH调节pH至8. 0。加入25 %反应体积的醇脱氢酶液、20~25 %反应体积的RUHSDH酶液、 0. 1~0. 5mMNADP+和20~35%异丙醇后补充50mM磷酸钾缓冲液（pH8. 0)至最终反应体 积。底物终浓度在50~100g/L，反应在25°C、300~400rpm和pH7. 8~8. 0下进行，反 应时间20~24小时。每隔一定时间取样在甲醇里稀释50~100倍，微孔过滤后10μL进 样液相分析。液相检测使用安捷伦C-18柱为分析柱，ImM磷酸二氢钾：乙腈=45:55 (体积 比）为洗脱剂，柱温35°C，检测波长210nm。反应结束后（>99. 0%转化率），用2NNaOH调节 反应液pH至产物全部溶解，然后加入0. 5~1. 0%娃藻土在50~60°C搅拌0. 5~1小时 后过滤。滤液在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2. 0左右，继续搅拌20~30 分钟后过滤得到熊去氧胆酸粗品。在有机溶剂如乙酸乙酯里加入25-30% (重量比）的熊 去氧胆酸粗品，加热到60~70°C用碱（如三乙胺）溶解后，继续搅拌回流1~2小时。待 上述溶液冷却并过滤除去固形物后，用盐酸溶液调节滤液pH至2. 0左右，过滤得到的结晶 真空干燥后得到精制的熊去氧胆酸。
[0037] 表三RUHSDH突变子催化底物7-KLCA合成熊去氧胆酸的比较
[0038]
[0039] 有益效果
[0040] 1、使用高效的7β_类固醇脱氢酶及其突变子酶，以及辅酶再生系统来催化合成 胆酸化合物特别是熊去氧胆酸，底物浓度高达l〇〇g/L，转化率为99. 2-99. 5%，重量收率高 达94-96%。酶可以通过发酵方法廉价易得，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合 于工业化生产；
[0041] 2、酶促反应条件温和，不使用化学法用到的金属钠或者Pd/C等催化氢化还原剂， 工业化放大生产容易控制而且安全。产生的废水容易处理，环境友好；
[0042] 3、酶促反应选择性高，与化学法比较副产物少，产品后提取和精制简单。
【附图说明】
[0043] 图1对7β-类固醇脱氢酶催化下的熊去氧胆酸的合成以及醇脱氢酶催化下的辅 酶NADPH的循环再生。
【具体实施方式】
[0044] 实施例1
[0045] 分别将含有重组DNApET21a(+)-RUHSDH、pET21a(+)-RU-8C2 和 pET21a(+) -RU-4F9的大肠杆菌BL21 (DE3)接种到含有50mLLB培养基（100μg/mL氨苄） 的250mL三角摇瓶中，37°C和300转/份过夜培养后，以10%的接种量接入装有400mLLB 培养基（100μg/mL氨苄）的2L摇瓶中，继续在37°C和300转/分下培养2小时直至0D600 达到1. 0。加入终浓度为0. 2mM的IPTG，在25°C下诱导表达4小时后离心收集细胞。细胞 悬浮于20mL100mM的磷酸缓冲液（pH8. 0)中超声破碎，离心后得到重组粗酶液。RUHSDH野 生型酶、突变子RU-8C2和突变子RU-4F9酶活（正向/反向）分别为：5· 3/10. 6单位/mL、 8. 5/25. 6 单位 /mL、16. 7/48. 5 单位 /mL。
[0046] 实施例2
[0047] 将含有重组DNApET21a(+) -RUHSDH的大肠杆菌BL21 (DE3)平板上单菌落接种到