两个装有250mLLB培养基（100μg/mL氨苄）的1L摇瓶中，在37°C和300转/分下振荡 培养15小时。将两个摇瓶里的种子液合并成500mL，接种到5L的起始培养基中，起始培养 基含有：30g/L的甘油，25g/L的磷酸二氢钾，10g/L的硫酸胺，10g/L的七水硫酸镁，0. 4g/ L的七水硫酸铁。重组大肠杆菌在10L发酵罐里进行通气搅拌培养，温度30°C，pH7.0,调 节搅拌和通气控制溶氧在25%。待起始培养基里的甘油耗尽后，开始流加诱导培养基（乳 糖：50g/L，甘油：200g/L)诱导酶的产生。流加速度为60-250mL/小时，在3小时内逐步达 到最大流速。温度30°C，pH7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在25%。总的诱导时间为10小 时，细胞湿重达到115g/L。离心收集细胞，并于-20度保存。称取50g湿细胞，悬浮于440mL 的100mM的磷酸缓冲液（pH8.0)中并超声破碎，离心后得到RUHSDH野生型重组酶液。重 组酶液酶活（正向/反向）为5. 8/12. 3单位/mL，酶液于-20°C保存，用于UDCA合成。
[0048] 实施例3
[0049] 使用和实施例2同样的方法来对含有重组DNApET21a(+)-RU_8C2的大肠杆菌 BL21(DE3)进行发酵，总的诱导时间为9小时，细胞湿重达到110g/L。离心收集细胞，并 于-20°C保存。称取50g湿细胞，悬浮于450mL的100mM的磷酸缓冲液（pH8. 0)中并超声 破碎，离心后得到RU-8C2突变子重组酶液。此重组酶液酶活（正向/反向）为9. 8/25. 2 单位/mL，酶液于-20 °C保存，用于UDCA合成。
[0050] 实施例4
[0051] 使用和实施例2同样的方法来对含有重组DNApET21a(+)-RU-4F9的大肠杆菌 BL21(DE3)进行发酵，总的诱导时间为10小时，细胞湿重达到114g/L。离心收集细胞，并 于-20°C保存。称取50g湿细胞，悬浮于440mL的lOOmM的磷酸缓冲液（pH8. 0)中并超声 破碎，离心后得到RU-4F9突变子重组酶液。此重组酶液酶活（正向/反向）为17. 0/59. 0 单位/mL，酶液于-20°C保存，用于UDCA合成。
[0052] 实施例5
[0053] 使用和实施例2同样的方法来对含有重组DNApET2la(+) -LKDH的大肠杆菌 BL21(DE3)进行发酵，总的诱导时间为10小时，细胞湿重达到120g/L。离心收集细胞，并 于-20°C保存。称取50g湿细胞，悬浮于420mL的lOOmM的磷酸缓冲液（pH8. 0)中并超声 破碎，离心后得到用于辅酶再生的醇脱氢酶重组酶液。此重组酶液酶活为36. 0单位/mL，酶 液于-20°C保存，用于UDCA合成过程中的辅酶再生。
[0054] 实施例6
[0055] 取30. 6g含量为98%的7-KLCA,悬浮在100mL的lOOmM磷酸钾缓冲液（pH7. 8) 中，用2NNaOH调节pH至8. 0。加入150mL实施例5的醇脱氢酶液和150mL实施例2的 7β-类固醇脱氢酶（RUHSDH)野生型重组酶液，用lOOmM磷酸二氢钾溶液调节pH至7. 8。 继续加入178mg辅酶NADP+二钠盐和200mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为600mL， 底物终浓度在50g/L。反应在25°C、350rpm和pH7. 8~8. 0下进行，24小时后转化率为 69. 7%〇
[0056] 实施例7
[0057] 取30. 6g含量为98%的7-KLCA,悬浮在100mL的lOOmM磷酸钾缓冲液（pH7. 8) 中，用2NNaOH调节pH至8. 0。加入150mL实施例5的醇脱氢酶液和150mL实施例3的 7β-类固醇脱氢酶（RUHSDH)突变子RU-8C2重组酶液，用lOOmM磷酸二氢钾溶液调节pH 至7. 8。继续加入178mg辅酶NADP+二钠盐和200mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为 600mL，底物终浓度在50g/L。反应在25°C、350rpm和pH7. 8~8. 0下进行，24小时后转化 率为85%。
[0058] 实施例8
[0059] 取30. 6g含量为98%的7-KLCA,悬浮在100mL的lOOmM磷酸钾缓冲液（pH7. 8) 中，用2NNaOH调节pH至8. 0。加入150mL实施例5的醇脱氢酶液和150mL实施例4的 7β-类固醇脱氢酶（RUHSDH)突变子RU-4F9重组酶液，用lOOmM磷酸二氢钾溶液调节pH 至7. 8。继续加入178mg辅酶NADP+二钠盐和200mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为 600mL，底物终浓度在50g/L。反应在25°C、350rpm和pH7. 8~8. 0下进行，24小时后转化 率为99. 4%。
[0060] 实施例9
[0061] 取6L2g含量为98%的7-KLCA,悬浮在100mL的lOOmM磷酸钾缓冲液（pH7. 8) 中，用2NNaOH调节pH至8. 0。加入150mL实施例5的醇脱氢酶液和150mL实施例4的 7β-类固醇脱氢酶（RUHSDH)突变子RU-4F9重组酶液，用lOOmM磷酸二氢钾溶液调节pH 至7. 8。继续加入178mg辅酶NADP+二钠盐和200mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为 600mL，底物终浓度在100g/L。反应在25°C、350rpm和pH7. 8~8. 0下进行，24小时后转 化率为99. 2%。
[0062] 实施例10
[0063] 取实施例8反应液，用2NNaOH调节其pH至产物全部溶解。加入1. 0 %硅藻土在 50~60°C搅拌1小时后过滤。滤液冷却后，在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH 为2. 0左右，继续搅拌30分钟后过滤得到熊去氧胆酸粗品。在乙酸乙酯里加入上述熊去氧 胆酸粗品（重量比30% )，加热到60~70°C滴加三乙胺溶解后，继续搅拌回流2小时。待 上述溶液冷却并过滤除去固形物后，用盐酸溶液调节滤液pH至2. 0左右，过滤得到的结晶 真空干燥后得到精制的熊去氧胆酸28. 3g，重量收率（从7-KLCA出发）为94. 6%，经检测 符合欧洲药典标准。
【主权项】
1. 一种7β-类固醇脱氢酶的突变子，其特征在于所述突变子的氨基酸序列SeqID NO:4,编码核苷酸序列为SeqIDNO:3 ;或所述突变子的氨基酸序列SeqIDNO:6,编码核 苷酸序列为SeqIDNO:5。2. 如权利要求1所述的的突变子的应用，其特征在于所述的突变子用于催化底物 3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA。3. 如权利要求1所述的的突变子的应用，其特征在于所述的催化底物3α-羟基-7-氧 代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA的反应，反应中所需要的辅酶由醇脱氢酶催 化异丙醇而合成，从而实现辅酶的循环再生；所述的醇脱氢酶的核苷酸序列为SeqIDNO: 7、氨基酸序列为SeqIDNO: 8。4. 一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于将采用权利要求1所述的突变子催化底物 3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA，同时采用权利要求3所述 的醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。5. 如权利要求4所述的一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于获得熊去氧胆酸粗品 在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品。
【专利摘要】本发明提供7β-羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法；一种7β-类固醇脱氢酶的突变子，其特征在于所述突变子的氨基酸序列Seq？ID？NO：4，编码核苷酸序列为Seq？ID？NO：3；或所述突变子的氨基酸序列Seq？ID？NO：6，编码核苷酸序列为Seq？ID？NO：5。使用高效的7β-类固醇脱氢酶及其突变子酶，以及辅酶再生系统来催化合成胆酸化合物特别是熊去氧胆酸，底物浓度高达100g/L，转化率为99.2-99.5%，重量收率高达94-96%。酶可以通过发酵方法廉价易得，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合于工业化生产。
【IPC分类】C12N9/04, C12P33/06
【公开号】CN105274070
【申请号】CN201510681787
【发明人】刘志斌, 刘经辉, 吴庆斌, 周敦秀
【申请人】南京普瑞特生物科技有限公司, 刘志斌
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月20日