IDN0:14):
[0120]
[0121] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，r代表A/G多态即 SNP位点rs662。
[0122] 酶切后的产物序列分别如下：
[0123] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段161bp(该片段下 游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加3个碱基）序列（SEQIDNO:15):
[0124]
[0125] 该多态位点含有G等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段44bp(该片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少3个碱基）序列（SEQIDNO:16):
[0126] attctgggagatgtatttgggtttagcgtggtcgtatgttgtct44
[0127] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs662位点扩增后出现205bp片断。经 Hinfl酶切后电泳会出现205bp、161bp和44bp三种片段（其中44bp在电泳图中不易分 辨）。
[0128] 酶切后电泳进行基因型判断：GG型为161bp-个片段，AG型有205bp和161bp两 种片段，AA型为205bp-个片段。
[0129] 多态结果，共检测50例人员，检测结果发现rs662位点出现GG型16例、AG型27 例和AA型7例。
[0130] 实施例4人口腔黏膜细胞测定P0N1基因rs662多态
[0131] 主要试剂及仪器同实施例1，内切酶采用MluCI。参考《分子克隆技术》中酚-氯 仿抽提法提取口腔黏膜细胞基因组DNA。
[0132] PCR反应所采用的上游引物是SEQN0:17，下游引物是SEQN0:18。
[0133] 上游引物：5'TAATCCTGTAATGTTCAATACCTTCACC3'（SEQIDN0:17);
[0134] 下游引物：5，TATAGTAGACAACATACGACCACGCTAAACCCAAATACATCTCCCAGM 3'（SEQIDNO:18)
[0135]PCR扩增除退火温度是67°C外，其余反应条件同实施例1 ;酶切反应除内切酶采用 MluCI酶外，其余反应条件同实施例1。上述酶切产物经1倍浓缩后在3. 5 %琼脂糖凝胶5V/ cm条件下，电泳50min，于紫外灯下拍照鉴定。
[0136]结果：
[0137] 扩增后序列（位于SEQIDNO: 1碱基序列的364-551处，共188bp)，所获得的扩增 产物序列如下（SEQIDN0:19):
[0138]
[0139] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，r代表A/G多态即 SNP位点rs662。
[0140] 酶切后的产物序列分别如下：
[0141] 该多态位点含有A等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段137bp(该片段下 游序列因酶切形成粘性末端而比上游序列增加4个碱基）序列（SEQIDNO:20):
[0142]
[0143] 该多态位点含有A等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段5lbp(该片段下游 序列因酶切形成粘性末端而比上游序列减少4个碱基）序列（SEQIDNO:21):
[0144]aattctgggagatgtatttgggtttagcgtggtcgtatgttgtctactata51
[0145] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs662位点扩增后出现188bp片断。经 MluCI酶切后电泳会出现188bp、137bp和51bp三种片段（其中51bp在电泳图中不易分 辨）。
[0146] 酶切后基因型判断：AA型为137bp-个片段，AG型有188bp和137bp两种片段， GG型为188bp-个片段。
[0147] 多态结果，共检测64例人员，检测结果发现rs662位点出现AA型20例、AG型35 例和GG型9例。
【主权项】
1. 一种测定人P0N1基因rs662位点多态性的方法，包括： 提供待测人基因组DNA; 提供扩增人P0N1基因rs662位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有 错配碱基A; 以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得 含RATTC片段或RATT的扩增产物，其中R为人P0N1基因rs662位点上的待定碱基A或G; 提供限制性内切酶； 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及 根据所得酶切产物来确定人P0N1基因rs662位点上的待定碱基R是A还是G， 其中，限制性内切酶为仅能够切开GATTC片段与AATTC片段之一，或者GATT片段与AATT片段之一的限制性内切酶。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在所得扩增产物上，下游引物的错配碱基A与R的 互补碱基之间相隔两个碱基AT。3. 根据权利要求2所述的方法，其中在所得扩增产物上，下游引物末端碱基与R的互补 碱基相邻或不相邻。4. 根据权利要求1所述的方法，其中限制性内切酶为能切开GATTC片段的HinfI、TfiI 或其同裂酶。5. 根据权利要求1所述的方法，其中限制性内切酶为能切开AATT片段的MluCI或其同 裂酶。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长 度的未切断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产 物，通过判断酶切产物所包含的片段类型来确定人P0N1基因rs662位点上的待定碱基R是 A还是G。7. 根据权利要求6所述的方法，其中判断酶切产物所包含的片段类型是通过凝胶电泳 联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。8. 根据权利要求7所述的方法，其中参照图是扩增产物在凝胶电泳标准设定时间后经 紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图像位置，其中第一参照图像位 置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图像位置则针对的是切断后具有 较长片段的扩增产物。9. 根据权利要求1所述的方法，其中通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增 产物的总片段长度在l〇〇bp至300bp之间，并且下游引物的片段长度至少为35bp，使得酶切 切掉部分片段占总片段的长度的百分比超过20%。10. -种用于测定人P0N1基因rs662位点多态性的试剂盒，其包含： 用于PCR扩增人P0N1基因rs662位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引 物具有错配碱基A以获得含RATTC片段或者RATT片段的扩增产物，其中R为人P0N1基因 rs662位点上的待定碱基A或G;以及 仅能够切开GATTC片段与AATTC片段之一的限制性内切酶，或者切开GATT片段与AATT片段之一的限制性内切酶。
【专利摘要】测定人PON1基因rs662位点多态性的方法及试剂盒。该方法包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人PON1基因rs662位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有错配碱基A；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含RATTC片段或RATT片段的扩增产物，其中R为人PON1基因rs662位点上的待定碱基A或G；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人PON1基因rs662位点上的待定碱基R是A还是G。限制性内切酶为仅能够切开GATTC片段与AATTC片段之一，或者GATT片段与AATT片段之一的限制性内切酶。本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105274214
【申请号】CN201510618596
【发明人】姚武, 张光辉, 任静朝, 邓娜, 袁利飞, 王团伟, 王彭彭, 段晓冉, 冯晓蕾, 刘素娜, 李娟 , 杨永利, 施学忠, 王威
【申请人】郑州大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年9月24日