拍照鉴定。
[0117] 结果：
[0118] 扩增后序列（其位于SEQIDNO: 1碱基序列中446-705处，共260bp)，所获得的扩 增产物序列如下（SEQIDN0:14):
[0119]
[0120] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，y代表C/T多态即 SNP位点rs3093816。
[0121] 经内切酶Rsal酶切后的产物序列分别如下：
[0122] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段206bp序列（SEQ IDNO:15)：
[0123]
[0124] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段54bp序列（SEQID NO:16)：
[0125] actagaaatataacagatttttgtttagatttcttttcattgaattactgtagt54
[0126] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs3093816位点扩增后出现260bp片断，经 Rsal酶切后电泳会出现260bp、206bp和54bp(其中54bp电泳图中不易分辨）三种片断。
[0127] 酶切后基因型判断：CC型为206bp-个片段，TC型有260bp和206bp两种片段， TT型为260bp-个片段。
[0128] 多态结果，共检测34例人员，检测结果发现rs3093816位点出现CC型9例、TC型 13例和TT型12例。
[0129] 实施例4人口腔黏膜细胞测定CCNH基因rs3093816多态性
[0130] 主要试剂及仪器同实施例1，内切酶为Rsal;参考《分子克隆技术》中酚-氯仿抽 提法提取肺组织炔基因组DNA。
[0131] PCR反应所采用的上游引物是SEQIDN0:17,下游引物是SEQIDN0:18。
[0132] 上游引物：5,TTAACTAGAAATATAACAGATTTTTGTTTAGATTTCTTTTCATTGAATTA CTGTAGT3'(SEQIDNO:17)；
[0133] 下游引物：5'TTATCCTTAAGTTATTTCCCATTACATCTTTTTC3'（SEQIDN0:18)
[0134] PCR扩增除退火温度是66°C外，其余反应条件同实施例1。
[0135] PCR扩增后，取PCR产物10yL，加入5U内切酶Rsal和2yL10X酶切缓冲液和灭 菌双蒸水组成20μL反应体系，37°C水浴中酶切12h后，即得酶切产物，酶切产物经1倍浓 缩后在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳45min，于紫外灯下拍照鉴定。
[0136] 结果：
[0137]扩增后序列（其位于SEQIDNO: 1碱基序列中443-703处，共261bp)，所获得的扩 增产物序列如下（SEQIDN0:19):
[0138]
[0139] 扩增后产物序列中下划线部分为上游、下游引物所对应的序列，y代表C/T多态即 SNP位点rs3093816。
[0140] 经内切酶Rsal酶切后的产物序列分别如下：
[0141] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段204bp序列（SEQ IDNO:20)：
[0142]
[0143] 该多态位点含有C等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段57bp序列（SEQID N0:21)：
[0144] ttaactagaaatataacagatttttgtttagatttcttttcattgaattactgtagt 57
[0145] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，rs3093816位点扩增后出现261bp片断，经 Rsal酶切后电泳会出现261bp、204bp和57bp(其中57bp电泳图中不易分辨）三种片断。
[0146] 酶切后基因型判断：CC型为204bp-个片段，TC型有261bp和204bp两种片段， TT型为261bp-个片段。
[0147] 多态结果，共检测10例人员，检测结果发现rs3093816位点出现CC型3例、TC型 4例和TT型3例。
【主权项】
1. 一种测定人CCNH基因rs3093816位点多态性的方法，包括： 提供待测人基因组DNA; 提供扩增人CCNH基因rs3093816位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物 具有错配喊基G; 以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得 含GTAY片段的扩增产物，其中Y为人CCNH基因rs3093816位点上的待定碱基C或T; 提供限制性内切酶； 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及 根据所得酶切产物来确定人CCNH基因rs3093816位点上的待定碱基Y是C还是T， 其中，限制性内切酶为仅能够切开GTAC片段与GTAT片段之一的限制性内切酶。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在所得扩增产物上，上游引物的错配碱基G与Y之 间相隔两个碱基TA。3. 根据权利要求2所述的方法，其中在所得扩增产物上，上游引物末端碱基与Y相邻。4. 根据权利要求2所述的方法，其中在所得扩增产物上，上游引物末端碱基不与Y相 邻。5. 根据权利要求1所述的方法，其中限制性内切酶为仅能切开GTAC片段的CviQI、 Rsal或其同裂酶。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长 度的未切断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产 物，通过判断酶切产物所包含的片段类型来确定人CCNH基因rs3093816位点上的待定碱基 Y是C还是T。7. 根据权利要求6所述的方法，其中判断酶切产物所包含的片段类型是通过凝胶电泳 联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。8. 根据权利要求7所述的方法，其中参照图是扩增产物在凝胶电泳标准设定时间后经 紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图像位置，其中第一参照图像位 置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图像位置则针对的是切断后具有 较长片段的扩增产物。9. 根据权利要求1所述的方法，其中通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增 产物的总片段长度在100至300bp之间，并且上游引物的片段长度至少为35bp，使得酶切切 掉部分片段占总片段的长度的百分比超过20%。10. -种用于测定人CCNH基因rs3093816位点多态性的试剂盒，其包含： 用于PCR扩增人CCNH基因rs3093816位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游 引物具有错配碱基G以获得含GTAY片段的扩增产物，其中Y为人CCNH基因rs3093816位 点上的待定碱基C或T;以及 仅能够切开GTAC片段与GTAT片段片段之一的限制性内切酶。
【专利摘要】测定人CCNH基因rs3093816位点多态性的方法及试剂盒。该方法包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人CCNH基因rs3093816位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有错配碱基G；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含GTAY片段的扩增产物,其中Y为人CCNH基因rs3093816位点上的待定碱基C或T；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人CCNH基因rs3093816位点上的待定碱基Y是C还是T。限制性内切酶为仅能够切开GTAC片段与GTAT片段之一的限制性内切酶。本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105274217
【申请号】CN201510618620
【发明人】李磊, 牛心华, 李国玉, 刘伟俊, 赵军峰, 李雷可, 张育红, 刘素香, 陈晓培
【申请人】郑州市职业病防治院
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年9月24日