次萃取液并以旋转浓缩仪去除溶剂(旋转蒸发温度为45°C，真空度为300mbar)，并在高真空冷冻干燥仪中干燥至恒重，得微藻总脂9.21g，总脂提取效率92.1%。无酶对照组除去复合酶未加入，其它所有步骤同上述破壁提取方法一样，获得总脂2.18g，油脂提取效率为21.8%。上述酶法破壁所提取获得总脂经硅胶薄层层析法分析，展开剂为正己烷/乙醚/乙酸乙酯，体积比为80/20/2，未发现油脂有氧化和水解酸败的情况。
[0018]实施例2:
一种新型生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是:
A、取光合自养小球藻新鲜藻泥500g，该藻泥固含量21.0%置于三口瓶中，加入400ml
0.05M的磷酸盐缓冲溶液(PH7.2)与藻泥搅拌充分混合，然后加入2.0g由甲壳素酶、果胶酶和碱性蛋白酶组成的复合酶(1:1:1，m/m/m)后搅拌均匀，置于50°C水浴中反应4h。
[0019]B、进一步，用0.1M氢氧化钠溶液调整体系pH值为7.8或8.3或9并将水浴温度升高至70或73或76或80°C继续维持2小时。反应完毕后将三角瓶冷却至40°C以下，然后往三口瓶加入150ml正己烷与乙醚的混合溶剂(1:1，v/v)剧烈摇动进行萃取，然后再加A 200ml甲醇后继续摇动萃取5min。
[0020]C、进一步将三口瓶中萃取体系转移至离心管中离心lOmin，离心转速5000rpm。
[0021]D、离心完毕后用吸管将离心上清液转移至玻璃蒸发瓶中。然后将水相倒入三口瓶中并加入150ml正己烷搅拌重复该搅拌提取步骤2次，合并萃取上清液用旋转浓缩仪浓缩脱除溶剂(旋转蒸发温度为45°C，真空度为300mbar)，并用高真空干燥仪进一步干燥脱除痕量水，得干燥后总脂32.6g，总脂提取率为88.7%。无酶对照组除去复合酶未加入，其它所有步骤同上述破壁提取方法一样，获得总脂4.59g，总脂提取效率为12.5%。上述酶法破壁所提取获得总脂经硅胶薄层层析法分析，展开剂为正己烷/乙醚/乙酸乙酯，体积比为80/20/2，未发现油脂有氧化和水解酸败的情况。
[0022]实施例3:
一种新型生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是:
A、取异养劣质壶藻发酵液20L置于玻璃萃取爸中，该发酵液的含固量为108g/L，依次加入磷酸二氢钾4.8g和36克磷酸氢二钾搅拌溶解均匀，然后加入32g由甲壳素酶、碱性蛋白酶组成的复合酶(1:1，m/m)后搅拌均匀后加热至45°C反应3h。
[0023]B、进一步，用0.1M氢氧化钠溶液调整体系pH值为7.5或7.8或8，并将水浴温度升高至70或74或78或80°C继续维持，1小时。反应完毕后在上述体系中加入5L乙醇和3L正己烧搅拌萃取30min。
[0024]C、进一步米用三相碟式分尚机分尚出油相，碟式尚心速率为6000rpm。
[0025]D、分理处的水相和固相倒回提取釜加入3L正己烷重复上述萃取步骤2次，然后将三次油相合并用薄膜蒸发器去除溶剂(薄膜蒸发油浴温度70°C，真空度为lOOmbar，转膜速度为120rpm)，然后进一步并采用高真空分子蒸馏设备去除痕量溶剂，得毛油1.22kg，油脂提取效率为97.4%。无酶对照组除去复合酶未加入，其它所有步骤同上述破壁提取方法一样，获得总脂554.9g，油脂提取效率44.3%。上述酶法破壁所提取获得总脂经硅胶薄层层析法分析，展开剂为正己烷/乙醚/乙酸乙酯，体积比为80/20/2，未发现油脂有氧化和水解酸败的情况。经GC/MS检测也未发现多不饱和脂肪酸组份发生明显改变。
[0026]实施例4:
一种新型生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是:
A、称取自养雨生红球藻藻粉10g置于具塞三角瓶中，加入50ml 0.05M的磷酸盐缓冲溶液(PH7.2)与藻充分混合，然后加入150mg由甲壳素酶、甘露糖异构化酶、木瓜蛋白酶组成的复合酶(1:1:1，m/m/m)后摇匀，置于50°C水浴中反应4h。
[0027]B、进一步，用0.1M氢氧化钠溶液调整体系pH值为7.5或7.7或8并将水浴温度升高至70或72或75或80°C继续维持1小时。反应完毕后将三角瓶冷却至室温并离心lOmin，转速5000rpm，进一步去除上清液，然后再再固相中加入50ml丙酮进行搅拌萃取30min。
[0028]C、进一步将上述含有丙酮和藻的萃取体系置于离心机离心lOmin，离心机转速为5000rpmo
[0029]D、进一步，用巴斯德吸管小心转移上清液至干净玻璃瓶中，并将固相转移至三角瓶中再加入50ml丙酮，重复上述萃取步骤，共计萃取三次。合并三次萃取液并以旋转浓缩仪去除溶剂(旋转蒸发温度为45°C，真空度为300mbar)，并在高真空冷冻干燥仪中避光干燥至恒重，得微藻总脂1.63g，总脂提取效率79.6%。无酶对照组除去复合酶未加入，其它所有步骤同上述破壁提取方法一样，获得总脂0.58g，油脂提取效率为28.3%。上述酶法破壁所提取获得总脂经硅胶薄层层析法分析，展开剂为正己烷/乙醚/乙酸乙酯，体积比为80:20:2，未发现油脂有氧化和水解酸败的情况。虾青素油脂、叶黄素等抗氧化色素还经TLC薄层层析法进一步检测，展开溶剂为正己烷/丙酮，体积比7:3，也未发现虾青素的氧化分解现象。
[0030]上面结合实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。
【主权项】
1.一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其步骤是: A、在培养收获的产油微藻的湿藻泥、藻浆、干燥粉或发酵液中依次加入磷酸盐缓冲溶液、生物酶催化剂，搅拌反应体系并加热至25°C -60°C，启动微藻细胞壁酶催化降解反应； B、酶催化降解反应完毕后，将步骤A中的反应体系调整pH值至7.5 - 9，将酶催化降解液温度提高至70 - 80°C并维持温度0.5-4小时； C、待反应完毕后，将步骤B中酶催化降解体系的温度降低至40°C，并向反应体系中加入萃取剂进行油脂萃取操作，再加入破乳剂后通过离心进行分层； D、将步骤C中分离获得的油相经减压蒸馏或薄膜蒸发浓缩获得微藻油脂，所述的减压蒸馏:操作温度40-60°C，真空度10mbar-500mbar ;所述的薄膜蒸发:操作温度为60-80°C，转膜速度为50-200rpm，真空度为40mbar-200mbar ； 所述的步骤A中的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01-0.5M，所述的生物酶催化剂为甲壳素酶与果胶酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、酯酶、甘露糖异构化酶、木瓜蛋白酶等生物酶中的一种或二至七种任意混合形成的复合酶；复合酶的用量为微藻干物质重量的0.1%-3.5% ;酶催化降解反应的温度为25°C -60°C ;酶催化降解反应的时间为:0.5小时-8小时； 所述的步骤C中的萃取剂为脂溶性不溶于水的溶剂为正己烷、环己烷、乙醚、氯仿、二氯甲烷、石油醚；所述的破乳剂为无机盐溶液，食盐水或甲醇或乙醇。2.根据权利要求1所述的一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其特征在于:所述的脂溶性是指物质能在非极性溶剂为苯、乙醚、四氯化碳、石油醚。3.根据权利要求1所述的一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其特征在于:所述的离心分层为碟式连续离心或者管式离心，离心速率大于转速5000 - 6000rpm，分离因素 Fr 5000 — 6000。4.根据权利要求1所述的一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，其特征在于:所述的微藻为自养或异养发酵培养的小球藻、栅藻、雨生红球藻产油微藻。
【专利摘要】本发明公开了一种生物酶催化破壁提取微藻油脂的方法，步骤是：A、在培养收获的产油微藻的湿藻泥、藻浆、干燥粉或发酵液中依次加入磷酸盐缓冲溶液、生物酶催化剂，搅拌并加热；B、酶催化降解反应完毕后，将反应体系调整pH值，将酶催化降解液温度提高并维持温度；C、待反应完毕后，将酶催化降解体系的温度降低，向反应体系中加入萃取剂进行油脂萃取，再加入破乳剂后通过离心进行分层；D、将分离获得的油相经减压蒸馏或者薄膜蒸发浓缩获得微藻油脂。方法易行，操作简便，针对产油微藻尤其是光合自养型产油微藻的高效破壁提油，降低了微藻提油过程的能量输入，提高了微藻能源的能效比，进而大大降低了微藻生物质能源的综合生产成本。
【IPC分类】C11B1/00, C11B1/10, C11B3/12
【公开号】CN105296137
【申请号】CN201510663965
【发明人】陈伟, 宋立荣, 吴莎
【申请人】中国科学院水生生物研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月15日