，倒置显微镜下观察，最后轻轻吹打上述原生质体，使其分布均 匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三 次，取平均值；根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结 果以每克叶片原生质体数表示（个/g)。
[0047] 酶解液的配制：纤维素酶15g/L，半纤维素酶10g/L，果胶酶10g/L，离析酶3g/L，甘 露醇 70g/L，10mM 的 MES 100ml/L，PH 为 5-6。
[0048] 洗液的配制：甘露醇70g/L，10mM的MES 100ml/L等体积混合，PH为5-6。
[0049] 结果：原生质体产量为8. 43 X 104个/g，见表1，纯度高，质膜完整，受损小，状态 好，最终得到污染少，产量大，纯度高，比较理想的原生质体。见图5。
[0050] 实施例4 :一种快速获得盐生草叶片原生质体的方法，取2个月盆栽苗的叶片，用 蒸馏水冲洗三次，滤纸将其表面擦干，沿主脉纵切，然后在25°C，黑暗条件下酶解2h后，在 培养皿中加入等体积的洗液，接着在黑暗条件下，放入25°C，30rpm的水平摇床lOmin,再 用5ml的移液枪将酶解液吸入10ml的试管，并将其放入25°C的离心机2350r离心10min， 用移液枪吸取4ml的上清液，倒置显微镜下观察，最后轻轻吹打上述原生质体，使其分布均 匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三 次，取平均值；根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结 果以每克叶片原生质体数表示（个/g)。
[0051] 酶解液的配制：纤维素酶10_30g/L，半纤维素酶20g/L，果胶酶20g/L，离析酶5g/ L，甘露醇 85g/L，10mM 的 MES150ml/L，PH 为 5-6。
[0052] 洗液的配制：甘露醇85g/L，10mM的MES150ml/L等体积混合，PH为5-6。
[0053] 结果：原生质体产量为8.40 X 104个/g，见表1，纯度高，质膜完整，受损少，状态 好，最终得到污染少，产量大，纯度高，比较理想的原生质体。见图6。
[0054] 表1盐生草叶片原生质体产量
[0055]
[0056] 注：小写字母a表示处理间差异水平不显著（p〈0. 05)。
[0057] 试验例：快速获得盐生草叶片原生质体的方法
[0058] 在制备与纯化原生质体的过程中，细胞的获得方式，酶解的时间以及离心率起到 了关键作用，本试验通过对上述三种关键因素进行优化，确定了最佳的制备和纯化盐生草 叶片原生质体的方法。
[0059] 1最佳盐生草叶片细胞获得方式的选择
[0060] 采用2种方式获得单细胞，第一种是通过培养无菌实生苗叶片来诱导愈伤组织， 然后通过愈伤组织悬浮培养得到单细胞或细胞团，接着将上述单细胞或细胞团酶解2. 30h， 最后在倒置显微镜下观察，无菌苗培养基主要由1/2 Hoagland营养液，6g/L的琼脂粉组 成，PH = 5. 7,诱导愈伤组织所用培养基主要由MS营养液+2. Omg/L 2, 4-D(2, 4-二氯苯氧 乙酸）+6g/L琼脂+30g/L蔗糖组成，PH = 5. 7。细胞悬浮培养所用培养基主要由MS营养液 +0· 25g/L 酪蛋白 +0· 5g/L PVP+2. Omg/L 2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸）+30g/L 蔗糖组成，PH =5. 7,所用的酶解液为纤维素酶20g/L，半纤维素酶10g/L，果胶酶10g/L，离析酶4g/L，甘 露醇 72. 86g/L，10mM 的 MES 100ml/L，PH 为 5. 5。
[0061] 第二种是用生长1-3个月的盆栽苗，取其靠近植株基部颜色深绿，肉质化严重的 叶片，蒸馏水冲洗三次，滤纸擦干后，沿其主脉纵切，然后迅速地放入盛有酶解液的玻璃培 养皿中，酶解2. 30h，最后在倒置显微镜下观察，所用的酶解液为纤维素酶20g/L，半纤维素 酶 10g/L，果胶酶 10g/L，离析酶 4g/L，甘露醇 72. 86g/L，10mM 的 MES 100ml/L，PH 为 5. 5。
[0062] 结果发现：第一种方式获得的原生质体量少，细胞畸形，杂质较多，并污染较严重， 很难通过离心纯化原生质体。第二种方式得到的原生质体产量大，杂质少，状态好，无污染， 通过离心可以得到比较理想的原生质体。
[0063] 2最适酶解时间的选择
[0064] 通过实验1优选出的最佳原生质体获得的基础上，对酶解时间进行研究，设置三 个处理，分别是处理A :酶解1. 30h，处理B :酶解2. 30h，处理C :酶解4h。将生长1-3个月 的盆栽苗，取其靠近植株基部颜色深绿，肉质化严重的叶片，蒸馏水冲洗三次，滤纸擦干后， 沿其主脉纵切，然后迅速地放入盛有酶解液的玻璃培养皿中，酶解时间为A，B，C，最后在倒 置显微镜下观察。
[0065] 结果发现：处理A和处理C得到的原生质体产量较少，处理B可得到大量较理想的 原生质体。
[0066] 3最适离心率的选择
[0067] 通过实验2选择出最佳酶解时间的基础上，对离心率进行了选择，设置三个处理， 分别是处理A :1500r，处理B :2500r，处理C :4000r，将生长1-3个月的盆栽苗，取其靠近 植株基部颜色深绿，肉质化严重的叶片，蒸馏水冲洗三次，滤纸擦干后，沿其主脉纵切，然后 迅速地放入盛有酶解液的玻璃培养皿中，酶解2. 30h，然后在培养皿中加入等体积的洗液， 接着在黑暗条件下，放入25°C，30rpm的水平摇床12min，再用5ml的移液枪将酶解液吸入 l〇ml的试管，并将其放入25°C的离心机离心10min,转速为处理A，处理B，处理C，最后用移 液枪吸取4ml的上清液，倒置显微镜下观察。
[0068] 结果发现：处理A试管上面4ml的溶液中原生质体较少，下面6ml溶液原生质体量 多，但杂质很多，处理C试管上面4ml的溶液和下面6ml溶液原生质体产量少且杂质较多， 原生质体有破碎的现象，处理B试管上面4ml的溶液中原生质体产量多，并且杂质少，下面 6ml的溶液中原生质体产量少，杂质多。因此处理B试管上面4ml的溶液中原生质体是较理 想的原生质体。
[0069] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其特征在于步骤为： (1) 幼苗的种植，选取饱满的盐生草种子3-5月种植于花盆，其蛭石与沙子体积比为 1:1-3:1 ； (2) 叶片的选取，待步骤（1)获得的幼苗长至1-3个月，用刀片切取靠近植株基部2/3 处的叶片，蒸馏水冲洗三次，待用； (3) 原生质体的获得，将步骤（2)获得的叶片用滤纸擦干，用刀片沿叶片主脉纵切，然 后放入酶解液中，22-25°C，黑暗条件下酶解2-3h; (4) 原生质体的纯化，在步骤（3)酶解后的酶解液中加入等体积的洗液，放置在黑暗条 件下，22-25°C，25-40rpm的水平摇床10-15min，然后用5ml的移液枪将酶解液吸入10ml的 试管，接着将其放入22-25°C的离心机2000-3000r离心8-10min，最后用移液枪吸取4-5ml 的上清液，即为纯的原生质体； (5) 原生质体产量的测定，吹打步骤（4)所述原生质体，使其分布均匀，用移液枪吸取 一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据 加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结果以每克叶片原生 质体数表示个/g。2. 如权利要求1所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其特征在于步骤（1)所 述的幼苗在自然条件下生长，蛭石与沙子120-180°C灭菌4-6h，并每隔3-5d喷洒一次1/2 Hoagland-Hoagland营养液。3. 如权利要求1所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其特征在于步骤（2)所 述选取的叶片为靠近植株基部2/3处，颜色深绿，肉质化严重，并且在10-30min内使用。4. 如权利要求1所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其特征在于步骤（3) 所述的酶解液的组成：纤维素酶10_30g/L，半纤维素酶5-20g/L，果胶酶5-20g/L，离析酶 2-5g/L，甘露醇60-85g/L，10mM的MES50-150ml/L，等体积混合，PH为5-6 ;所述的步骤（4) 洗液的组成：甘露醇60-85g/L，10mM的MES50-150ml/L等体积混合，PH为5-6。5. 如权利要求1所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其特征在于步骤（3) 所述的原生质体的获得，在制备原生质体时，清洗后叶片表面用滤纸擦干，然后用刀片在 10-30min内沿主脉纵切，接着用镊子拨入盛有酶解液的玻璃培养皿中，酶解液用超纯水配 制，调PH用K0H或HC1。6. 如权利要求1所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其特征在于步骤（4)所 述的纯化原生质体时，用l〇ml的圆底塑料试管以及水平转子的离心机，2000-3000r离心 8-10min，离心后，将溶液静止，时间为5-10min，再吸取4-5ml的上清液，最后在倒置显微镜 下观察原生质体的情况。7. 如权利要求1所述的快速获得盐生草叶片原生质体的方法，其特征在于步骤（5)所 述原生质体直径为10um-150um之间，原生质体共存于洗液当中。
【专利摘要】本发明涉及一种盐生草原生质体的制备及纯化的方法，它包括以下步骤：1.幼苗的种植；2.叶片的选取；3.原生质体的获得，用刀片沿其主脉纵切，然后放入酶解液中；4.原生质体的纯化，酶解后，加入等体积的洗液，最后用移液枪吸取4-5ml的上清液，即为较纯的原生质体；5.原生质体产量的测定，根据加入酶溶液中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体产量，计算结果以每克叶片原生质体数表示(个/g)。本发明简单易行，获得的原生质体纯度高，数量可达8.4×104个/g,也可避免组培污染，能为体细胞的杂交，各种细胞器(如细胞核，叶绿体，线粒体，液泡等)的分离，生物反应器的构建以及原生质体融合育种等奠定基础。
【IPC分类】C12N5/04
【公开号】CN105316276
【申请号】CN201510894100
【发明人】姚立蓉, 王化俊, 汪军成, 孟亚雄, 李葆春, 马小乐, 杨柯, 赖勇, 司二静, 任盼荣, 李吉睿
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月27日