是微藻的内源性热激蛋白70启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的内 源性热激蛋白70A启动子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是微藻的外源性启动 子。根据本申请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性启动子。根据本申 请的某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白启动子。根据本申请的 某些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白70启动子。根据本申请的某 些实施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性热激蛋白70A启动子。根据本申请的某 些实施方式，所述热激蛋白启动子包含如SEQ ID N0:3序列所示的序列。根据本申请的某 些实施方式，所述热激蛋白启动子是SEQ ID N0:3序列所示的序列。根据本申请的某些实 施方式，所述启动子是蛋白核小球藻的内源性泛素启动子。
[0065] "选择标记"指可以根据标记的基因来用于选择的鉴定因子。选择标记通常是抗生 素或化学抗性基因。本领域已知并使用的选择标记基因的示例包括但不限于：青霉素、卡那 霉素、庆大霉素、链霉素、G418等基因。根据本申请的某些实施方式，所述表达载体包含抗 生素抗性基因。根据本申请的某些实施方式，所述抗生素抗性基因是G418抗性基因。
[0066] "转化"指将核酸片段转移到宿主生物中的分子生物学过程。经转化后包含核酸片 段的宿主生物称为"转基因"生物或"转化"的生物。载体可以通过本领域已知的转化方法 转移到宿主生物中。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是微藻。根据本申请的某 些实施方式，所述宿主生物是蛋白核小球藻。根据本申请的某些实施方式，所述宿主生物是 蛋白核小球藻FACHB-9。根据本申请的某些实施方式，所述转化方法包括电穿孔法、基因枪 法、农杆菌介导法、激光微束穿孔法或玻璃珠法。根据本申请的某些实施方式，所述转化方 法是电穿孔法。
[0067] "油脂"是油和脂肪的统称，一般在室温下是液体形态的称为油，是固体或半固体 形态的称为脂。油和脂都是高级脂肪酸甘油酯，其中油是不饱和高级脂肪酸甘油酯，脂肪是 饱和高级脂肪酸甘油酯。从化学成分上来讲，油脂的主要成分通常是三分子高级脂肪酸与 一分子甘油脱水形成的酯。油脂为混合物，没有固定的熔点和沸点。
[0068] "脂肪酸"是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链。脂肪酸通常以酯的形式存 在，天然存在的游离形式的脂肪酸非常少见。通常用简单的代号来表示不饱和脂肪酸的碳 原子数目及双键的数目和位置，如18:2,18表示有18个碳原子，2表示有两个双键。高等动 植物中最丰富的脂肪酸是含16或18个碳原子的脂肪酸，例如棕榈酸（软脂酸）、油酸、亚油 酸和硬脂酸。根据本申请的某些实施方式，本申请涉及使用III型NAD激酶在提高微藻细胞 中脂肪酸和油脂含量的应用。
[0069] "生物柴油"是指由动植物油脂（脂肪酸甘油三酯）与醇（甲醇或乙醇）经酯交换 反应得到的脂肪酸单烷基酯，最典型的成分是脂肪酸甲酯。生物柴油是生物质能的一种，其 物理性质与石化柴油比较接近。生物柴油的主要特点包括稳定性好、含硫量低环保特性好、 芳香族烷烃含量低、十六烷值高、安全性能好、润滑性好并且可部分添加到石化柴油中等。 生产生物柴油的方法包括化学法、生物酶合成法等。根据本申请的某些实施方式，本申请涉 及使用III型NAD激酶在生产脂肪酸或生物柴油中的应用
[0070] 本申请中使用"提高"、"促进"、"增加"、"增多"、"超过"、"改善"以及其他类似含义 的术语是指转化III型NAD激酶的微藻中NADPH含量、油脂或脂肪酸的含量多于未转化III型 NAD激酶的野生型对照藻株。例如所述转化III型NAD激酶的微藻中NADPH含量提高了至少约 39%，例如包括但不限于提高约39%、约40%、约41%、约42%、约43%、约44%、约45%、 约 46%、约 47%、约 48%、约 49%、约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80 %、约85 %、约90 %、约95 %、约1倍、约1. 5倍、约2倍、约2. 5倍、约3倍、约3. 5倍、约4 倍、约4. 5倍、约5倍、约5. 5倍、约6倍、约6. 5倍、约7倍、约7. 5倍、约8倍、约8. 5倍、约 9倍、约9. 5倍、约10倍、约15倍、约20倍。例如所述转化III型NAD激酶的微藻中油脂的含 量提高了至少约45 %，例如包括但不限于提高约45 %、约46 %、约47 %、约48 %、约49 %、 约 50%、约 55%、约 60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 95%、约 1倍、约1. 5倍、约2倍、约2. 5倍、约3倍、约3. 5倍、约4倍、约4. 5倍、约5倍、约5. 5倍、 约6倍、约6. 5倍、约7倍、约7. 5倍、约8倍、约8. 5倍、约9倍、约9. 5倍、约10倍、约15 倍、约20倍。所述转化III型NAD激酶的微藻中脂肪酸的含量提高了至少约2倍，例如包括 但不限于提高约2. 1倍、约2. 2倍、约2. 3倍、约2. 4倍、约2. 5倍、约2. 6倍、约2. 7倍、约 2. 8倍、约2. 9倍、约3. 0倍、约3. 5倍、约4倍、约4. 5倍、约5倍、约5. 5倍、约6倍、约6. 5 倍、约7倍、约7. 5倍、约8倍、约8. 5倍、约9倍、约9. 5倍、约10倍、约15倍、约20倍。
[0071] 在本申请中当"约"用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动±10%、±9%、 ±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或 ±1%的范围内。
[0072] 除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中（包括 权利要求的上下文中）使用的术语"一种"、"一个"、"所述"、"该"以及"至少一个"和类似指 代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所 使用的术语"包含"、"具有"、"包括"和"含有"被解释为开放式术语（即"包括但不限于"）。 除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技 术人员的理解，以任何合适的顺序进行。
[0073] 本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申 请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间 存在冲突，应以本申请中的内容为准。
[0074] 本申请描述了优选的实施方式和实施例，本领域技术人员在阅读本申请的基础 上，可以对本申请所述的实施方式和实施例进行适当的改变。因此，本申请包括法律允许范 围内对本申请权利要求书中主题的所有等同的修改和变化。
[0075] 实施例
[0076] 下面参考实施例和附图详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解的是， 下述实施例是为了举例说明的目的，不应以任何方式解释为对本发明的限制。本发明的保 护范围由后附的权利要求所限定。
[0077] 实施例1 :包含蛋白核小球藻内源件启动子的微藻表汰载体的构律
[0078] 本实施例构建包含蛋白核小球藻内源性启动子的微藻表达载体。在本实施例中， 所述蛋白核小球藻内源性启动子是蛋白核小球藻的内源性HSP70A启动子，所述微藻表达 载体是pGreen0029系列表达载体。
[0079] 1. lpEASY-Blunt_Hsp70A 质粒构建
[0080] (1)取50mL蛋白核小球藻藻液，冷冻离心去上清后，液氮研磨提取其RNA存 于-80°C冰箱冻成块状的藻泥，转移到事先倒好液氮预冷的研钵中，迅速研磨，整个过程中 不断加入适量的液氮，防止RNA降解。于不含RNA酶（RNase-free)的Ep管中事先加入 lml Trizol裂解液（购自Invitrogen公司），向其中加入50-100mg研磨好的藻粉，漩祸 振荡混勾，室温放置lOmin使其充分裂解，12000rpm，4°C离心10min。将上清转移至另一 RNase-free Ep管中，加入200 yL预冷的氯仿，上下颠倒混勾15s，室温放置3min，12000rpm 4°C离心15min。将上清转移至另一 RNase-free Ep管中，注意不要吸到中间层的DNA，加入 500 μ L异丙醇，手动振荡15s，室温放置lOmin后12000rpm，4°C离心10min。弃上清，向沉 淀中加入lml 75%乙醇，吹打悬浮温和振荡，在7500rpm，4°C离心5min，用移液器小心吸弃 上清。在超净台上风干RNA，加入20-40 μ L RNase-free H20,轻弹管壁以充分溶解，留5 μ L 左右测定浓度，剩下的-80 °C保存。
[0081] 通过Nano drop测定RNA浓度（0D260)以及纯度（0D260/280)。同时设定250V电 压，1. 5%琼脂糖凝胶电泳验证提取的RNA质量。
[0082] (2) RNA反转录成cDNA用于基因克隆
[0083] 向200 μ L的RNase-free PCR管中加入5 μ L溶解的RNA，在PCR仪上进行反转录。 第一步的条件是65°C 5min，4°C冷却待用。再在冰上依次加入表1中的试剂（购自Toyobo 公司的 gDNA 去除型 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix，产品号：FSQ_301):
[0084] 表1 cDNA合成体系
[0086] 小心混勾，37°C，5min。再按照以下步骤在PCR仪上进行反转录：37°C 15min，50°C， 5min，98°C 5min，反应结束后获得cDNA，置于-20°C保存备用。
[0087] 蛋白核小球藻热激蛋白70A启动子的核苷酸序列示于SEQ ID N0:3。用含Hind III位点的上游引物HsphinF和含BamH I位点的下游引物HSpbamR从上述获得的蛋白核小球 藻cDNA中克隆出Hsp70A启动子基因片段。回收纯化后连接到pEASY-Blunt (北京全式金 生物技术有限公司，产品号：CB101-02)克隆载体，使用测序引物M13F和M13R进行PCR测 序，验证序列正确后提取质粒。
[0088] 用于克隆的上游引物HsphinF和下游引物HSp bamR，以及用于PCR测序的M13F和 Ml3R引物的序列如表2所示。
[0089] 表 2 pEASY-Blunt_Hsp70A 质粒构建引物
[0091] 1. 2Hind III 和 BamH I 双酶切连接获得 pGreen II 0029-Hsp70A-NosT 质粒
[0092] 如图 1 所示，使用 Hind III 和 BamH I 双酶切 pEASY-Blunt-Hsp70A 质粒和 pGreen II 0029-Npt II质粒（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中