AATGGGGGA-3'
[0036]内侧引物peBIPl(如SEQ ID NO. 4所示）：
[0037] 5, -TTCTGCCAATTCGGTCCTGTGCttttttGTTTCAAGACGGGTCGGAT-3，
[0038](2)引物组2
[0039]外侧引物peF32 (如SEQ ID NO. 5所示）
[0040] 5, -TCGAGTTGGTGTGGGGTG-3'
[0041]外侧引物peB32 (如SEQ ID Ν0· 6所示）
[0042] 5' -GGCAATCGTGATTGCTCAGA-3'
[0043]内侧引物peFIP2 (如SEQ ID Ν0· 7所示）：
[0044] 5, -AGACGGGTCGGATAGATGACCAttttttATGTGCCTTCTGCCAATTCG-3'
[0045]内侧引物peBIP2 (如SEQ ID NO. 8所示）：
[0046] 5' -TCGTGTGCGCAAGTCATTGGGttttttCGTCGTATCCTTGCGGATTC-3'
[0047]2、不同引物组的扩增效率如图1所示。
[0048] 实施例2LAMP反应的特异性检测
[0049] 1、为验证本发明引物组和LAMP反应体系的有效性和特异性，我们同时使用了多 个不同种群的穿刺短体线虫和其他非靶标的线虫的DNA作为模板进行检测，具体线虫种类 如表1所示。
[0050] 表1实验使用的线虫种群及对应的可视化检测结果
[0051]
[0053] 2、分别提取表1中各线虫的DNA，分别利用引物组1和引物组2,按照实施例2的 中所述的LAMP反应条件进行LAMP扩增。
[0054] 3、结果如附图2、附图3和表1所示，图2中，3、4、5、6、7、8号管发生颜色变化，为 阳性；图3中，2、3、4、5、6、7、8号管发生颜色变化，为阳性。
[0055] 结果表明，本发明所述的LAMP引物组中，引物组2对桑尼短体线虫有非特异反应， 只有引物组1能有效的检测不同种群的穿刺短体线虫，并且对非靶标线虫不会有非特异性 的扩增，即不能够扩增检测到非靶标线虫，对穿刺短体线虫的特异性非常好。
[0056] 同时，本发明所述的LAMP方法能有效的检测到单条的靶标线虫，具有非常好的灵 敏性，能够满足实际的检测和定量工作需要。
[0057] 实施例3LAMP反应的可视化检测及灵敏性检测
[0058] 1、综上所述，本发明建立的快速检测穿刺短体线虫的环等温扩增方法如下：
[0059] PCR反应体系为：1yLDNA，引物PeFIPl/PeBIPl各 1. 6μΜ，引物PeF31/PeB31 各 0.2μM，dNTP0.35μM，2.5yL10XBST2.0DNA聚合酶缓冲液（BST2.0DNApolymerase buffer)，0· 8M甜菜碱，1· 5μLMgS04(100mM)，1μLBST2. 0DNA聚合酶（BST2.ODNA polymerase)，余量ddH20 补足，共 25μL〇
[0060] 反应条件：65°C反应60min。
[0061] 2、根据上述反应体系和优化后的反应条件进行LAMP反应，反应结束后，不仅能通 过琼脂糖凝胶电泳进行检测，还能够通过添加SYBRGreenI染料或钙黄绿素进行可视化检 测，结果判断方法更灵活、更方便。
[0062] 3、分别以不同浓度的穿刺短体线虫线虫DNA为模板，以上述反应体系和反应条件 进行LAMP反应，反应结束后，使用2 %琼脂糖凝胶电泳对上述产物进行检测。
[0063] 同时，在LAMP反应产物中加入1μL5000XSYBRGreenI染料（购自鼎国生物， 使用前加入灭菌水稀释至5000X的浓度）混匀后观察结果，阳性产物呈现出由橘红色变为 荧光黄或荧光绿色的颜色变化（具体颜色的深浅由产物的含量决定），说明验证可视化结 果的准确。
[0064] 可视化如附图4所示，图4中除了CK，其他组均发生颜色变化，为阳性，电泳检测与 可视化的结果一致，也说明了本发明检测方法结果的稳定性和可靠性。
[0065] 同时上述结果也说明了本发明所述的LAMP反应方法能检测到0. 1条穿刺短体线 虫的DNA模板，具有非常好的检测灵敏性。
【主权项】
1. 一种快速检测穿刺短体线虫的环等温扩增引物组，其特征在于，包括外侧引物 peF31/peB31和内侧引物peFIPl/peBIPl;引物peF31的序列如SEQIDNO. 1所示，引物 peB31的序列如SEQIDNO. 2所示，引物peFIPl的序列如SEQIDNO. 3所示，引物peBIPl 的序列如SEQIDNO. 4所示。2. 权利要求1所述环等温扩增引物组在检测穿刺短体线虫方面的应用。3. 权利要求1所述环等温扩增引物组在制备检测穿刺短体线虫的试剂或试剂盒方面 的应用。4. 一种快速检测穿刺短体线虫的环等温扩增方法，其特征在于，该方法是以样品DNA 为模板，利用权利要求1所述外侧引物对peF31/peB31和内侧引物对peFIPl/peBIPl进 行环介导等温扩增反应。5. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应结果 的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有 穿刺短体线虫DNA，即为穿刺短体线虫阳性； 或者向扩增产物中加入SYBRgreenI或钙黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿 色，则判定样品中含有穿刺短体线虫DNA，即为穿刺短体线虫阳性。6. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环等温扩增方法的反应体 系为：1yLDNA，引物peFIPl和peBIPl各 1. 6μΜ，引物peF31 和peB31 各 0· 2μΜ，dNTP 0.35μM，2.5yL10X^572.0DNA聚合酶缓冲液，0.8M甜菜碱，1.5yLMgS04 (100mM)，l μL仍72. 0DNA聚合酶，余量ddH20补足，共25μL。7. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环等温扩增方法的反应条 件为：65°C反应60min。8. -种快速检测穿刺短体线虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所 述外侧引物对peF31/peB31和内侧引物对peFIPl/peBIPl。9. 根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所使用的检测方法为权利要 求4所述环等温扩增方法。10. 权利要求4所述环等温扩增方法或权利要求8所述试剂盒在检测穿刺短体线虫方 面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测穿刺短体线虫的环等温扩增引物组。所述引物组包括外侧引物对peF31/peB31和内侧引物对peFIP1/peBIP1，引物的序列分别如SEQ？ID？NO.1～4所示。本发明以该引物组建立了环等温扩增方法，以样品DNA为模板进行环等温扩增，反应结束后可通过两种方式判断结果：一是扩增产物进行电泳，出现特异阶梯状条带的样品判定为阳性；二是通过向反应体系中加入SYBR？green？I，通过肉眼观察出现颜色变化的样品为阳性。该环等温扩增方法对仪器设备要求低、快速、安全、特异性好、敏感性强，为穿刺短体线虫的检测，尤其是基层检疫单位对穿刺短体线虫的快速检测工作提供了技术支持，具有很好的推广应用价值。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105349688
【申请号】CN201510940050
【发明人】林康艺
【申请人】林康艺
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月15日