甲。
[0030] 所述的试剂，可W是单独为检测生物样品中MicroRNA-4454表达量的寡聚核巧 酸；也可W是单独为检测MicroRNA-7975表达量的寡聚核巧酸；或者为检测MicroRNA-4454 与MicroRNA-7975表达量的寡聚核巧酸的组合。
[0031] 检测所述的MicroRNA-4454和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核巧酸包括反转 录引物、PCR特异性引物等。
[0032] 在本发明的一个优选实施例中，检测所述的MicroRNA-4454表达量的寡聚核巧酸 序列如沈QIDNO: 1所示。
[0033] 在本发明的一个优选实施例中，检测所述的MicroRNA-7975表达量的寡聚核巧酸 序列如沈QIDNO:2所示。
[0034] 本发明的第Ξ方面，提供了一种检测指甲中的hsa-mi;r-4454和/或hsa-mi;r-7975 表达量的试剂或试剂盒。
[00巧]所述的试剂或试剂盒，是通过检测指甲中的hsa-mi;r-4454,hsa-mi;r-7975水平的 变化，监测或早期预测银屑病的可能或进程，W便尽早采取措施或药物治疗，防止银屑病症 状恶化，进而防止累积全身。
[0036] 本发明通过对银屑病患者与正常人指甲中hsa-mi;r-4454,hsa-mi;r-7975的含量 比较发现：银屑病患者指甲中hsa-mi;r-4454,hsa-mi;r-7975含量明显低于正常人，约低于 正常人群的10倍左右，运个结果显示了hsa-mi;r-4454,hsa-mi;r-7975的含量变化情况，可 W作为银屑病的早期预测手段。
[0037] 本发明试剂盒中的两个检测分子hsa-mi;r-4454和hsa-mi;r-7975是根据已知的生 物信息学查得的成熟体序列（详见ht化://www.mirbase.org/)
[0038] hsa-mir-4454 的成熟体序列：GGAUCCGAGUCACGGCACCA(SEQIDN0:1)
[0039] hsa-mir-7975 的成熟体序列：AUCCUAGUCACGGCACCA(SEQIDN0:2)
[0040] 所述的试剂，为检测指甲中MicroRNA-4454表达量的寡聚核巧酸和/或 MicroRNA-7975表达量的寡聚核巧酸。
[0041] 所述的试剂盒，包含上述试剂，即包含检测指甲中MicroRNA-4454表达量的寡聚 核巧酸和/或MicroRNA-7975表达量的寡聚核巧酸。
[0042] 本发明提供了一种早期预测银屑病的hsa-mi;r-4454和/或hsa-mi;r-7975检测 试剂盒，该试剂盒由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的引物系统由特异性的 hsa-mi;r-4454，hsa-mi;r-7975引物组成，具体序列如下：
[0043] hsa-mir-4454 引物为：5'-GGATCCGAGTCACGGCACCA-3'（沈QIDNO:3)
[0044] hsa-mir-7975 引物为：5'-ATCCTAGTCACGGCACCA-3'（沈QIDNO:4)
[0045] 上述试剂盒的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成， 扩增系统由Mir-X?miRNAFirst-StrandSynthesisandSYBRqRT-PCRkit试剂组成。
[0046] 本发明的试剂盒，具体组成如下：
[0047] A)非特异反转录引物 1管 100μ1/管
[0048] Β)hsa-mir-4454 或hsa-mir-7975 特异性PCR上游引物，1 管，浓度：10μΜ， 100μ1/ 管；
[0049] C)通用3'端实时定量PCR下游引物1管 100μ1/管
[0050] D)内参U6 1 管 100μ1/管
[0051] 巧标准品 1管 100μ1/管
[0052] 巧萃取液 1管 2000μ1/管
[0053] G)酶 1 管 500μ1/ 管
[0054] Η)裂解液 1管 500μ1管
[00巧]I)RNA提取液 1管 2000μ1/管
[0056] J)氯仿 1 管 1000μ1/ 管
[0057] Κ)异丙醇 1管 5ml/管
[0058] L) 70 % 乙醇 1 管 10ml管
[0059] M)ddH20 1 管 2000μ1/ 管。
[0060] 非特异反转录引物：商品化寡聚核巧酸（自动加尾microRNA反转录引物，制造商： 日本TAKARABio)
[0061] hsa-mir-4454 与hsa-mir-7975 特异性引物：即沈QIDN0:3 与沈QIDN0:4
[006引通用3'端实时定量PCR下游引物：商品化寡聚核巧酸（制造商：日本TAKARABio) [006引 内参U6:商品化寡聚核巧酸（制造商：日本TAKARABio)
[0064] 标准品：50例正常人指甲提取总microRNAs混合物的反转录产物；
[0065] 萃取液：尿素、Tris-盐酸、十二烷基硫酸钢（SDS)
[0066] 裂解液：二硫苏糖醇值TT)
[0067] RNA提取液：商品化试剂，制造商：日本NIPPONGE肥
[0068] 使用本发明试剂盒监测或早期预测银屑病，首先，将若干正常人群编组，用本发明 试剂盒检测正常人群指甲中hsa-mi;r-4454,（orhsa-mi;r-7975)含量，W此作为对照的标准 数据。再用相同的方法检测未知患者指甲中hsa-mi;r-4454,（orhsa-mi;r-7975)含量，对照 上述标准数据，即可初步确定该患者是否为银屑病患者，W便作进一步检查确诊。
[0069] 本发明的第四方面，提供了上述试剂或试剂盒检测指甲中的hsa-mir-4454和/或 hsa-mir-7975表达量的方法，即本发明提供了一种银屑病患者指甲中的hsa-mir-4454和/ 或hsa-mi;r-7975的检测方法，具体步骤如下：
[0070] 按常规采取指甲，用萃取剂等使指甲融解，再用总RNA提取试剂处理，加氯仿 离屯、后取上层水相，并富集指甲中的小RNA;由反转录系统反转录hsa-mi;r-4454和/或 hsa-mi;r-7975 成cDNA;用扩增系统进行Real-timePCR扩增，测定hsa-mi;r-4454 和 / 或 hsa-mi;r-7975 含量。
[0071] 本发明的试剂盒，可W是单独检测指甲中MicroRNA-4454的表达量；也可W是单 独检测MicroRNA-7975的表达量；或者是同时检测MicroRNA-4454和MicroRNA-7975的表 达量；当本发明的试剂盒同时检测MicroRNA-4454和MicroRNA-7975的表达量时，敏感性和 特异性更高。
[0072] 本发明为银屑病的早期筛查和临床诊断提供了新检测手段，而且相比于血清学检 测无创、无痛、快速、灵敏。
【附图说明】
[007引图1 :指甲融解前后比较，其中A为融解前，B为融解后；
[0074] 图2 :miRNA忍片技术筛选了与Pso相关的miRNAs表达谱中具有代表性的若干microRNAs与正常人群指甲中microRNAs表达谱相比的改变情况，列举的代表性microRNAs 为miRNA-203，miRNA-424，miRNA-1266，miRNA-19A，miR-4454W及miR-7975，其中， miR-4454在银屑病患者中的表达水平降低超过检测灵敏度范围，其检测数值降至0,有显 著改变，另外，miR-7975与miRNA-424也出现了明显的下调。
[007引图3 :标准品倍比稀释法建立标准曲线，其中A为扩增miR-4454的标准曲线，B为 扩增miR-7975时的标准曲线；
[0076] 图4 :正常人与银屑病患者指甲中miR-4454的差异表达检测，同时检测了黑色素 瘤患者和特应性皮炎患者的指甲microRNA作为对照，其中，相较于正常对照人群，银屑病 患者指甲中的miR-4454表达水平明显降低。图中，NS:正常人指甲；Pso:银屑病患者指甲； 匪：黑色素瘤患者指甲；AD:特应性皮炎；
[0077] 图5 :正常人与银屑病患者指甲中miR-7975的差异表达检测，同时检测了作为对 照的黑色素瘤患者和特应性皮炎患者的指甲microRNAs表达，其中，相较于正常对照人群， 银屑病患者