用于靶标分析的荧光传感器、用于靶标分析的试剂盒、和使用其的靶标分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于靶标分析的荧光传感器、用于靶标分析的试剂盒、和使用其的靶 标分析方法。
【背景技术】
[0002] 在各种领域如临床治疗领域、食品领域、和环境领域中，存在对靶标检测的需求。 对于靶标的检测来说，通常，使用与靶标特异性结合的抗体的方法被广泛用作利用与靶标 的相互作用的方法。这些年来，新开发了使用对靶标特异性的核酸分子(通常所说的适体 (ap tamer))代替抗体的方法。
[0003] 作为使用适体的方法，例如，报道了在其中适体和DNA核酶(DNAzyme)连接的传感 器。DNA核酶是一种DNA分子，当其形成G四联体(G-quartet)时，其与过氧化物酶等类似使氧 化还原反应的催化活性激活。根据这种传感器，可以通过将靶标与适体结合并且测量在其 中靶标与适体结合的传感器中DNA核酶的催化活性来间接检测靶标(非专利文献1)。
[0004]还报道了，G四联体形成的DNA核酶当其与卟啉形成复合物时产生荧光（非专利文 献2和3)。因此，新报道的是不通过测量DNA核酶的氧化还原反应的催化活性而是通过测量 由在其中适体和DNA核酶连接的传感器中复合物的形成而产生的荧光来检测靶标的方法。 然而，需要提供具有更适合实际应用的新型结构的荧光传感器。
[0005] 引用列表
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献l:Teller等人，Anal.Chem.，2009，νο1·81，ρρ·9114-9119
[0008] 非专利文献2: Jiangtao Ren等人，Anal · Bioanal · Chem ·，2011，399，ρρ · 2763-2770
[0009] 非专利文献3:Seung Soo Oh等人，PNAS，2010，vol.l07,32,pp.14053-14058
[0010] 发明概述
[0011] 本发明要解决的问题
[0012] 因此，本发明意在提供用于靶标分析的新型荧光传感器、用于靶标分析的试剂盒、 和使用其的靶标分析方法。
[0013] 解决问题的手段
[0014] 本发明提供用于靶标分析的荧光传感器，所述荧光传感器包括选自由以下（I)、 (11)、（111)、（1￥)、和以)组成的组的至少一种核酸分子，所述核酸分子各自包含形成6四联 体的G四联体形成区（D)和与靶标结合的结合区(A)，其中在不存在靶标的情况下，所述G四 联体形成区(D)中G四联体的形成被抑制，并且在靶标的存在下，所述靶标与所述结合区(A) 接触，由于所述接触而在所述G四联体形成区（D)中形成所述G四联体，所述G四联体形成区 (D)和卟啉形成复合物，并且所述复合物产生荧光：
[0015] (I)单链核酸分子，所述单链核酸分子按此顺序包含所述G四联体形成区(D)、阻断 区（B)、和所述结合区(A)，其中所述阻断区（B)与所述G四联体形成区(D)的部分区域(Dp)互 补，并且在阻断区(B)侧的所述结合区(A)的末端区域(Ab)与所述G四联体形成区(D)的所述 部分区域(Dp)的相邻区域(Df)互补并且还与在所述阻断区(B)侧的对侧的所述结合区(A) 的末端区域(Af)互补；
[0016] (II)单链核酸分子，所述单链核酸分子按此顺序包含所述G四联体形成区（D)、阻 断区(B)、所述结合区(A)、和稳定区（S)，其中所述阻断区(B)与所述G四联体形成区(D)的部 分区域(Dp)互补，并且在结合区(A)侧的所述阻断区（B)的末端区域(Ba)与所述稳定区（S) 互补；
[0017] (III)单链核酸分子，所述单链核酸分子包含所述G四联体形成区（D)、茎形成区 (S D)、所述结合区(A)、和茎形成区（SA)，其中所述茎形成区（SD)包含与所述G四联体形成区 (D)互补的序列，并且所述茎形成区（S A)包含与所述结合区(A)互补的序列；
[0018] (IV)单链核酸分子，所述单链核酸分子包含所述G四联体形成区(D)和所述结合区 (A)，其中所述G四联体形成区（D)包含形成G四联体的第一区域(D1)和第二区域(D2)，并且 所述第一区域(D1)位于所述结合区(A)的一个端侧并且所述第二区域(D2)位于所述结合区 (A)的另一个端侧；以及
[0019] (V)双链核酸分子，所述双链核酸分子包含第一链(ssl)和第二链(ss2)，其中所述 第一链(ssl)包含所述G四联体形成区（D)和所述结合区(A)，并且所述第二链(ss2)包含茎 形成区（S D)和茎形成区（SA)，所述茎形成区（SD)包含与所述G四联体形成区(D)互补的序列， 并且所述茎形成区（S A)包含与所述结合区(A)互补的序列。
[0020] 本发明还提供用于靶标分析的试剂盒，所述试剂盒包括:传感器;和试剂，其中所 述传感器是根据本发明所述的用于靶标分析的荧光传感器，并且所述试剂包括卟啉。
[0021] 本发明还提供用于靶标分析的方法，所述方法包括下列步骤:使样品与根据本发 明的用于靶标分析的荧光传感器接触;并且检测所述传感器中在卟啉的存在下由所述G四 联体形成区(D)与卟啉的复合物产生的荧光以检测所述样品中的靶标。
[0022]本发明的效果
[0023] 根据本发明的用于靶标分析的荧光传感器，可以通过利用荧光的产生以简单且有 效的方式间接分析靶标。因此，例如，对于在各种领域如临床治疗领域、食品领域、和环境领 域中的研究和试验来说，本发明是非常有用的。
[0024] 附图简述
[0025] [图1]图1A至1C是示出本发明的传感器中的核酸分子的实例的示意图。
[0026][图2]图2A至2C是示出本发明的传感器中的核酸分子的另一个实例的示意图。 [0027][图3]图3A和3B是示出本发明的传感器中的核酸分子的又一个实例的示意图。 [0028][图4]图4A和4B是示出本发明的传感器中的核酸分子的又一个实例的示意图。
[0029] [图5]图5是示出本发明的传感器中的核酸分子的又一个实例的示意图。
[0030] [图6]图6是示出本发明的传感器中的G四联体的实例的示意图。
[0031] [图7]图7A和7B是示出本发明的传感器中的核酸分子的又一个实例的示意图。 [0032][图8]图8A和8B是示出本发明的实施例2中的荧光强度的图表；图8A示出了各自含 有三聚氰胺传感器的反应溶液的结果;并且图8B示出了各自不含三聚氰胺传感器的反应溶 液的结果。
[0033][图9]图9A和9B是示出本发明的实施例3中的荧光强度的图表；图9A示出了各自含 有三聚氰胺传感器的反应溶液的结果;并且图9B示出了各自不含三聚氰胺传感器的反应溶 液的结果。
[0034][图10]图10是示出本发明的实施例3中的含有三聚氰胺传感器的反应溶液的荧光 强度与不含三聚氰胺传感器的反应溶液的荧光强度之间的差异的图表。
[0035]示例性实施方案描述
[0036] 在根据本发明的荧光传感器中，例如，所述单链核酸分子(I)或（II)按此顺序包含 所述G四联体形成区(D)、所述阻断区(B)、和来自5'侧的所述结合区(A)。
[0037] 在根据本发明的荧光传感器中，例如，所述单链核酸分子(III)包含所述茎形成区 (SD)和所述茎形成区（S A)作为所述茎形成区（S)，所述G四联体形成区（D)和所述茎形成区 (SD)包含彼此互补的序列，并且所述结合区(A)和所述茎形成区（S A)包含彼此互补的序列。
[0038] 在根据本发明的荧光传感器的单链核酸分子（III)中，例如，所述G四联体形成区 (〇)、所述茎形成区（5〇、所述结合区以）、和所述茎形成区（5/〇按以下顺序（1)、（2)、（3)、或 (4)连接：
[0039] (1)按所述结合区(A)、所述茎形成区（SD)、所述G四联体形成区（D)、和所述茎形成 区（S A)的顺序；
[0040] (2)按所述茎形成区（SA)、所述G四联体形成区(D)、所述茎形成区（S D)、和所述结合 区(A)的顺序；
[0041] (3)按所述G四联体形成区（D)、所述茎形成区（SA)、所述结合区（A)、和所述茎形成 区（S D)的顺序;或
[0042] (4)按所述茎形成区（SD)、所述结合区(A)、所述茎形成区（SA)、和所述G四联体形成 区(D)的顺序。
[0043] 在根据本发明的焚光传感器的单链核酸分子（IV)中，例如，所述第一区域(D1)和 所述第二区域(D2)在所述结合区(A)的位置的对侧的末端处包含彼此互补的序列。
[0044] 根据本发明的荧光传感器包括，例如，在所述G四联体形成区(D)和所述结合区(A) 之间的接头序列。
[0045] 根据本发明的荧光传感器还包括，例如，基底材料。所述核酸分子置于所述基底材 料上。
[0046] 在根据本发明的荧光传感器中，例如，所述核酸分子经由接头区与所述基底材料 连接。
[0047] 在根据本发明的荧光传感器中，例如，含有试剂的试剂部分进一步置于所述基底 材料上，并且所述试剂包括卟啉。
[0048] 在根据本发明的荧光传感器中，例如，所述卟啉是选自由下列各项组成的组的至 少一种:N-甲基中卟啉、Zn-DIGP、ZnPP9、和 TMPyP。
[0049] 在根据本发明的分析试剂盒中，例如，所述传感器是在其中所述核酸分子置于基 底材料上的传感器，并且含有所述试剂的试剂部分进一步置于所述基底材料上。
[0050] 在根据本发明的分析试剂盒中，例如，所述卟啉是选自由下列各项组成的组的至 少一种:N-甲基中卟啉、Zn-DIGP、ZnPP9、和 TMPyP。
[0051] 在根据本发明的分析方法中，例如，在所述检测步骤中的荧光的检测是荧光强度 的测量。
[0052]在根据本发明的分析方法中，例如，所述样品是选自由下列各项组成的组的至少 一种:原料奶、加工奶、和奶粉。
[0053]在根据本发明的分析方法中，例如，所述靶标是三聚氰胺。
[0054] 1.用于靶标分析的荧光传感器
[0055] 如上所述，根据本发明的用于靶标分析的传感器的特征在于其包括:选自由（I)、 (11)、（111)、（1￥)、和以)组成的组的至少一种核酸分子，所述核酸分子各自包含形成6四联 体的G四联体形成区（D)和与靶标结合的结合区(A)，其中在不存在靶标的情况下，所述G四 联体形成区(D)中G四联体的形成被抑制，并且在靶标的存在下，所述靶标与所述结合区(A) 接触，由于所述接触而在所述G四联体形成区（D)中形成所述G四联体，所述G四联体形成区 (D)和卟啉形成复合物，并且所述复合物产生荧光。
[0056] 在下文中，本发明的用于靶标分析的传感器也被称为传感器，并且所述区域也被 称为核酸区。例如，本发明中的单链核酸分子可以被称为单链核酸元件。此外，在G四联体形 成区（D)中，对G四联体形成的抑制也被称为断开(switching-〇FF)(或关闭（turning-OFF)) 并且G四联体的形成也被称为开启（switching-ΟΝ)(打开(turning-〇N))。
[0057] 通常已知G四联体(也被称为G-tetrad)为由四个G(鸟嘌呤)碱基形成的平面结构。 在本发明中，G四联体形成区(D)包含多个G碱基并且由在其中的多个G碱基形成G四联体。例 如，在本发明中，G四联体可以是平行式的或反平行式的。优选的是，G四联体是平行式的。在 本发明的传感器中的G四联体形成区（D)中形成的G四联体的数量没有特别地限定，并且可 以是，例如，一个平面或两个以上平面。优选的是，G四联体形成区（D)形成在其中G四联体在 彼此顶部堆叠的鸟嘌呤四倍体(也被称为G四倍体）。在本发明中，G四联体形成区(D)的序列 可以是任何序列，只要其允许G四联体的形成即可。优选的是，G四联体形成区(D)具有允许 鸟嘌呤四倍体形成的序列。
[0058] 在卟啉的存在下形成G四联体的区域当其与卟啉形成复合物时产生荧光。根据本 发明的传感器，在不存在靶标的情况下G四联体形成区(D)被抑制形成G四联体，并且G四联 体形成区(D)中G四联体的形成的抑制由于靶标与结合区(A)之间的接触而消除，并且结合 区(A)和G四联体形成区(D)在靶标的存在下形成G四联体。因此，根据本发明的传感器，在不 存在靶标的情况下，因为G四联体形成区（D)不能形成G四联体，不产生归因于G四联体形成 区（D)与卟啉的复合物的形成的荧光。另一方面，根据本发明的传感器，在靶标的存在下，G 四联体形成区（D)形成G四联体，并且产生归因于G四联体形成区（D)与卟啉的复合物的形成 的荧光。因此，例如，可以基于由G四联体形成区(D)与卟啉的复合物产生的荧光分析样品中 存在或不存在祀标或者祀标的量。
[0059] 作为形成G四联体的核酸分子，例如，已知产生酶的催化功能的核酸分子(催化性 核酸分子）。催化功能没有特别地限定并且是，例如，氧化还原反应的催化功能。例如，氧化 还原反应是在其中在由底物生成产物的过程中电子在两种底物之间转移的反应。对氧化还 原反应的类型没有特别地限定。氧化还原反应的催化功能可以是，例如，与酶相似的活性并 且具体是，例如，与过氧化物酶相似的活性(在下文中被称为"过氧化物酶样活性"）。过氧化 物酶活性可以是，例如，辣根过氧化物酶(HRP)活性。在催化性核酸分子是DNA序列的情况 下，其通常被称为DNA核酶(DNA enzyme或DNAzyme)。在催化性核酸分子是RNA序列的情况 下，其通常被称为核酶(RNA enzyme或RNAzyme)。在本发明中，例如，可以使用这种催化性核 酸分子作为G四联体形成区（D)。此外，在本发明中，G四联体形成区(D)可以是任何区域，只 要其能够形成G四联体即可，并且没有限定存在或不存在催化功能。
[0060] DNA核酶的实例包括在以下文章（1)至(4)中公开的核酸分子；
[0061 ] (1 )Travascio等人，Chem.Biol ·，1998，vol · 5，pp · 505-517;
[0062] (2)Cheng 等人，Biochemistry，2009，vo 1 · 48，pp · 7817-7823;
[0063] (3)丁61161'等人，厶仙1.〇16111.，2009，￥〇1.81，卩卩.9114-9119;和
[0064] (4) Tao等人，Ana 1 · Chem ·，2009，vo 1 · 81，pp · 2144-2149 〇
[0065] G四联体形成区（D)可以是，例如，单链核酸分子或双链核酸分子。例如，单链核酸 分子可以在单链G四联体形成区(D)中形成G四联体。例如，双链核酸分子包含第一区域(D1) 和第二区域(D2)，并且G四联体可以由第一区域(D1)和第二区域(D2)形成。后面的双链核酸 分子可以是，例如，在其中第一区域和第二区域间接连接的结构，其将参照以下核酸分子 (IV)被具体描述。
[0066] 对单链G四联体形成区（D)的长度没有特别地限定。长度的下限是，例如，11聚体、 13聚体、或15聚体。长度的上限是，例如，60聚体、36聚体、或18聚体