双组分杀白细胞素未见有这种报道。
[0294] 实例4:当共表达并在溶液中形成二聚时从大肠杆菌裂解液中共纯化重组LukG和 LukH
[0295]我们采用两种含不同抗生素抗性标记的质粒，每个质粒携带IukH或IukG基因，共 转染到相同的大肠杆菌细胞中，共表达了。LukG表达为融合蛋白，NusA/His6在N-端，使复合 物可以进行金属亲和纯化，而LukH以未标记形式表达。表达的诱导采用异丙基-β-D-硫代半 乳糖苷（IPTG)在20°C进行20小时实现。在可溶部分中发现两种蛋白质，这两种蛋白通过固 定化金属离子亲和色谱（IMAC)共纯化。NusA/His6标记通过(肠激酶)蛋白质水解脱除，得到 无标记的成熟的LukGH复合物，该复合物通过阳离子交换色谱进一步纯化。
[0296] 共表达稳定了各个蛋白质。虽然单个组分总是表达在大肠杆菌的不溶部分中（参 见实例1)，但是，在可溶部分中发现了共表达的LukGH。
[0297] SDS-PAGE表明，复合物中LukG: LukH的化学计量是1:1。为了确定溶液中复合物的 大小，我们采用配备静态光散射检测器的DynoPro NanoStar(Wyatt)仪器开展动态光散射 (DLS)测量（图5)。静态光散射检测器(MW-S)测定的分子量与异源二聚体的计算分子量 73kDa十分一致。
[0298] 实例5:采用重组LukGH复合物筛选高效LukGH中和mAb
[0299] 按照实例2所描述的相同方式，采用生物素化LukGH复合物为抗原，通过酵母表面 展示，开展抗体筛选。筛选出了 84个具有独特CDR序列的人mAb。按照实例3所描述，利用分化 的HL-60细胞或新鲜分离的人PMN，测量中和活性，抗体预培养采用高效LukGH复合物或在补 充有1 %酪蛋白氨基酸的RPMI-1640培养基中培养的金黄色葡萄球菌细胞产生的天然LukGH (培养上清液)完成。与采用LukG或LukH mAb得到的结果相反，采用LukGH复合物筛选出的抗 体被证明是有效的，它们中的3/4的半数最高抑制浓度（IC50)小于300nM。最有效mAb的IC50 <30nM(大约是IOmAb :毒素比）。实例如图6所示，图中示出了采用分化HL-60细胞时重组 LukGH复合物（图6A)或天然LukGH(图6B)的情况。当采用新鲜分离的人PMN作为靶细胞时，发 现了同样的效力等级次序(图7A)。
[0300] 由于LukGH以不同的变体存在，一个重要的方面是筛选能够中和不同金黄色葡萄 球菌菌株表达的所有LukGH变体的mAb。为此，在毒素中和试验中，还测试了MRSA252菌株表 达的差异最大的序列变体LukGH-属于CC30(克隆复合物)和ST36(序列类型）。该试验具有非 常大的区别能力，因某些mAb被证明高效，而其它并未显示出功能性（图7B)。当抗体被固定 在抗人捕捉传感器上，并对溶液（ΙΟΟηΜ，溶于PBS+3%BSA)中毒素的结合进行监测时，根据 For t eB i 〇测量的响应值，效力被证明与和LukGH复合物变体的结合相关。mAb与LukGH复合物 变体的结合显著优于与LukG或LukH变体的结合(图7C)。
[0301] 为了揭露LukGH中和抗体的作用模式，在没有或存在LukGH mAb的情况下，采用荧 光链霉亲和素(与生物素结合），在基于流式细胞术的表面染色试验中，对生物素化LukGH复 合物的结合进行监测。抗体的存在与缺乏荧光表面信号相关，表明在mAb与毒素结合时，与 推定受体的结合受到抑制（图8)。
[0302]总之，溶液中LukG和LukH形成复合物的发现导致防止人吞噬细胞溶解的有效毒素 中和抗体的鉴定。抗体的亚群具有广泛的结合特异性，交叉中和差别很大的LukGH序列。中 和LukGH mAb抑制了毒素和吞噬细胞的结合，从而防止溶解。mAb的这些特点使它们适合广 泛的临床应用。
[0303] 实例6:⑶I Ib/⑶18复合物作为LukGH人受体的鉴定
[0304]我们采用基于流式细胞术的表面染色法确定了，LukGH复合物与人PMN和分化的 HL-60细胞结合，但不与未分化HL-60细胞结合。这与毒素灵敏度有关，因为后者的细胞类型 完全耐受LukGH(未检测到任何细胞溶解）。这些数据表明，LukGH受体被PMN和分化HL-60细 胞表达。为了鉴定这种受体，利用生物素标记的LukGH(2yg)和IO 8个细胞，开展拉下实验。将 生物素化LukGH和其结合伴侣收集在链霉亲和素琼脂糖树脂（结合生物素）上，并采用SDS-PAGE分析。P丽和分化HL-60拉下样本中出现分子量150-和90-kDa的两种独特的蛋白质条 带，而未分化HL-60部分和未加 LukGH纯化的PMN样本中均没有这些条带（图9A)。将这些条带 从凝胶中切去，并开展质谱分析(肽质量指纹图谱）。将凝胶带消化(胰蛋白酶），得到的肽采 用纳米-LC-MS/MS测定，并对Mascot (http: //www.matrixscience · com)数据库，查询MS/MS 谱图。根据胰蛋白酶肽的质量，两种蛋白质被鉴定为⑶llb(150-kDa)和⑶18(90-kDa)(图 9B)。已知⑶Ilb和⑶18在PMN和分化HL-60细胞表面上形成复合物，亦称为补体受体3(CR3)， 或白细胞整合素 Mac-1 (FEMS Immunol .Med.Microbiol · 2002，34，255)。在抗-CDlIb特异性 mAb(Abeam ab52478)的蛋白质印迹法中，证实了在PMN和分化HL-60拉下材料中存在⑶I Ib (图9C)。这是一个耐人寻味的发现，完全解释了 LukGH的细胞类型特异性，据报道，对表达 ⑶Ilb/⑶18的人PMN、单核细胞和树突状细胞都有毒。普遍还认为，未分化HL-60细胞缺乏这 种复合物的表面表达。实际上，阳性CDllb/CD18染色经常用作体外HL-60细胞高效分化的标 记。肽质量分析也以较低分值鉴定了从PMN分离的150kDa条带中的⑶Ild(图9B) XDlld还与 ⑶18形成复合物，得到整合素 aDi32,整合素 aDi32在炎性巨噬细胞上显示上调并调节巨噬细 胞的粘附性及其迀移(Exp. Celt. Res . 2008，314，2569)。€0敗在氨基酸水平上58%与CR3相 同，是LukGH的一种可能的替代受体。
[0305]这些数据还解释了对小鼠和兔子细胞的毒素活性的缺乏或非常低的毒素活性(文 献Maiachowa et al ,2012报道，并被我们证实），因为啮齿动物⑶Ilb/⑶18与它们的人对应 物仅有~75 %的氨基酸一致性。同样，人⑶11d与小鼠变体仅~70 %相同。
[0306] 实例7: LukGH八聚体的晶体结构鉴定了对二聚体形成很重要的残基
[0307] 对2.8A分辨率的LukGH USA300的结构进行了解析，结果显示为八聚体孔式结构， 在不对称单元中有两个八聚体，每个八聚体由四个交替的LukG和LukH亚单元组成（图10A)， 与采用HIgAB(PNAS 108,17314,2011)获得的类似。毒素原体涉及八聚体中两种类型的界 面:链A和B之间的界面(界面1)及链B和C之间的界面(界面2)。界面1和界面2埋藏的表面积 分别是2188和2461A 2。在界面1，盖域(cap domain)之间发生主要的相互作用（图10B)，而在 界面2,在盖域之间和两个单体的边缘域〇之间都存在相互作用（图10C) IukGH八聚体两个 界面之间的接触残基的分析表明，界面1被34个氢键和一系列涉及来自LukH的残基Asp39、 △8卩75和48口197及来自1^11^的残基1^856、1^858、4坪23和1^8 218的静电相互作用稳定。在 界面2，一共有56个氢键，以及涉及盖域之间来自LukH的残基Arg49和Arg240及来自LukG的 残基Asp49和Glul71及边缘域之间来自LukH的残基Arg215和Arg234和来自LukG的残基 Aspl89和Aspl91的静电相互作用。当与HlgAB八聚体(pdb代码3B07)观察到的盐桥相比时， 在盖域之间发现的那些盐桥在LukGH和HIgAB八聚体之间（也在其它S和F组分之间）大多数 是保守的，而在边缘域之间（在界面2)，盐桥仅在LukGH中发现，涉及的残基在LukGH变体之 间是完全保守的（图1C)。根据两个界面中埋藏的表面积的大小，及在其它F组分和S组分时， 在界面2中缺少盐桥残基保守，LukGH二聚体最可能的界面是界面2(图10C)。为了证实这种 假设，如下文所述，我们将涉及静电相互作用的残基改为Ala，产生了界面突变体。LukH中的 Asp75和Aspl97突变为Ala，得到LukHl (界面ILukH突变体），LukG中的Arg23和Lys218突变为 Ala，得到LukGl (界面ILukG突变体）。为了制备第2界面突变体LukH2和LukG2，将LukH中的 Arg215、Arg234和 Arg240及 LukG 中的 Aspl89、Aspl91 和 Glul71 分别突变为 Ala。
[0308] LukGH变体被共转化，在20°C诱导复合物的共表达，如对WT复合物的一样。所有复 合物都在类似水平共表达，但是，不同变体之间可溶复合物的含量有变化;界面1的突变体： LukGlH、LukGHl和LukGlHl具有与WT复合物类似的溶解性，而界面2突变体:LukG2H、LukGH2 和LukG2H2大部分不溶。因此，界面1突变体复合物采用与WT LukGH类似的程序纯化，得到类 似的收率。采用圆二色谱(⑶)检查纯化LukGH变体的折叠，它们的⑶谱图基本上与WT复合物 的相同，表明这些突变对复合物的二级结构没有任何影响。
[0309] 单个组分：如WT LukG和LukH-样，对LukGl、LukG2及LukHl和LukH2进行了表达和 包涵体纯化。LukGl、LukG2和LukH2的收率与WT对应部分类似:LukH2的CD谱图与WT LukH吻 合良好，LukG的变体同样如此，虽然在蛋白质配制和获得谱图的pH 10.0 缓冲液中，所有 LukG蛋白质都主要表现出无规卷曲结构^LukHl的收率显著低于WT蛋白质，这一点得到了 LukHl是部分折叠的这一事实的支持，因此，在进一步的实验中未将其包括进去。
[0310] 将生物素化LukH或LukH2固定在链霉亲和素传感器上，测定LukG与预载传感器结 合的响应值，在Forte-Bio中对从单个组分形成LukGH复合物的情况进行监测。与LukH的结 合显著高于与LukH2的结合（图11A)，这与LukH2中的突变影响二聚体界面相符。LukG和LukH 变体的混合物与戊二醛的交联(图11B)证实，界面2突变体不能形成LukGH二聚体，但是界面 ILukG突变体能够形成二聚体，其水平与WT组分中观察到的类似。
[0311] 参考文献
[0312] Malachowa N，Kobayashi SD，Braughton KR，Whitney AR，Parnell MJ，Gardner DJ，Deleo FR. Staphylococcus aureus Ieukotoxin GH promotes inflammation .J Infect Dis.2012 Oct；206(8)：1185-93.Epub 2012 Aug 7.
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[0314] Dumont AL，Yoong P，Surewaard BG，Benson MA，Nijland R，van Strijp JA， Torres VJ Staphylococcus aureus Elaborates Leukocidin AB To Mediate Escape from within Human Neutrophils.Infect Immun.2013 May;81(5):1830-41·doi: 10.1128/IAI.00095-13.Epub 2013 Mar 18.
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[0317] Yakubenko ? V.P.?Exp. Ce11. Res.2008 ? 314 ? 2569
【主权项】
1. 一种分离的金黄色葡萄球菌杀白细胞素抗原，其包含LukGH复合物。2. 根据权利要求1所述的抗原，其中LukGH复合物包括LukG和LukH组分的二聚体或低聚 体。3. 根据权利要求1或2所述的抗原，其中LukGH复合物由源自金黄色葡萄球菌菌株的重 组蛋白与/或蛋白组成。4. 根据权利要求3所述的抗原，其中LukG和LukH组分由天然来源纯化的重组宿主细胞 共表达与/或共重折叠。5. 根据权利要求1至4任一项所述的抗原，其中抗原是以可溶形式的蛋白复合物的形式 提供。6. 根据权利要求1至5任一项所述的抗原，其中所述抗原能够与人CDllb/CD18受体结 合。7. -种抗体，其与LukGH复合物特异性结合。8. 根据权利要求7所述的抗体，其中抗体中和LukGH复合物。9. 根据权利要求7或8所述的抗体，其中抗体与源自USA300克隆，优选源自TCH1516菌株 的LukGH复合物及至少一种LukGH复合物的变体结合。10. 根据权利要求7至9任一项所述的抗体，其中与源自USA300克隆的LukGH复合物相 比，LukGH复合物变体在LukG或LukH任一组分的氨基酸序列中有至少一个点突变。11. 根据权利要求7至10任一项所述的抗体，其中LukGH复合物变体包括含有选自SEQ ID8、12、13、14、15、16、17、18、19和20的氨基酸序列的LukG组分与/或含选自SEQID6、10、 21、22、23、24、25、26、27和28的氨基酸序列的LukH组分。12. 根据权利要求7至11任一项所述的抗体，其中源自USA300克隆的LukGH复合物包括 含SEQID4氨基酸序列的LukG组分与/或含SEQID2氨基酸序列的LukH组分。13. 根据权利要求7至12任一项所述的抗体，其中抗体交叉中和LukGH复合物和LukGH复 合物变体。14. 人⑶1lb/⑶18复合物，其用于确定金黄色葡萄球菌LukGH双组分溶细胞素结合或毒 性的方法中。15. 根据权利要求14使用的CDllb/CD18复合物，其中CDllb/CD18复合物是以其天然形 式或分离形式或固定化形式使用。
【专利摘要】本发明主题涉及一种包含LukGH复合物的分离的金黄色葡萄球菌杀白细胞素抗原、一种与LukGH复合物特异性结合的抗体，及在确定金黄色葡萄球菌LukGH双组分溶细胞素的结合或毒性的方法中使用的人CD1lb/CD18复合物。
【IPC分类】C07K14/31, C07K16/12, G01N33/50
【公开号】CN105473613
【申请号】CN201480038825
【发明人】E·纳吉, A·巴达罗, H·劳哈, Z·毛焦里奇, S·策特尔, M·B·巴托斯
【申请人】阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年5月16日
【公告号】CA2913088A1, EP2999713A2, US20160108106, WO2014187746A2, WO2014187746A3