CCATGGGGGTTAAGCTGGACGACGCGCAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID N0.8所示)和下游弓I物R-putA:TTAACCTATAGTCATTAAGCTGGCGTTACCGCCAGCGGCGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID N0.9所示)。以实施例3中构建好的质粒pUC18-pxyl-proH-proB-proA-kanR为模板，经PCR扩增得到含有卩1'0!1、口1'013、口1'04和1^1111?四个表达框的0嫩片段。
[0033]2、将RED重组酶表达质粒载体pKD46利用电击转化法转入大肠杆菌W3110中，得到菌株 W3110/pKD46;
3、LB培养基中加入l%(m/V，质量体积百分比)的L-阿拉伯糖，30°C震荡培养菌株W3110/PKD46至0D600达到0.6，然后制备感受态细胞。将上述制备好的DNA片段电转化入该感受态细胞内，涂布卡那霉素抗性USyg/mDLB平板，得到转化子。
[0034]4、挑取转化子，用菌落PCR鉴定。菌落PCR引物为F-kanR:CATGGATCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG (SEQ ID N 0.6 所示)和 R - p u t A 2:TGTAACATCCTCCGGCTACCTGCSEQ ID N0.10所示)，其中引物F-kanR位于表达片段内部，引物R-putA2位于大肠杆菌染色体putA基因的外部，如果有1.5kb左右DNA片段被扩增出，可证明表达框正确插入了 put A基因处，所得即为预期的菌株。
[0035]实施例5:羟脯氨酸的发酵生产
1、种子和发酵培养基
种子培养基为LB培养基(成分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L)。
[0036]发酵培养基成分:蛋白胨10g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸氢二钾lg/L，硫酸铵10g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.5g/L。按比例配好后，高压蒸汽灭菌，备用。
[0037]补料培养基:葡萄糖650g/L。
[0038]2、发酵过程
过夜培养种子培养基，按5%的接种量后转接至发酵培养基，37°C好氧培养，控制pH为6.8，溶氧20%以上，当葡萄糖耗完后，按照5g/Lh的速率流加葡萄糖，培养至发酵结束。
[0039]在发酵后期取样检测羟脯氨酸含量，至含量不再增加为止。
[0040]经检测，60小时后，发酵液中羟脯氨酸浓度可达28.3g/L，L_脯氨酸浓度为2.3g/L。[0041 ]实施例6:羟脯氨酸的发酵生产
与实施例5的不同之处在于，发酵过程为:过夜培养种子培养基，按2%的接种量后转接至发酵培养基，33°C好氧培养，控制pH为7.0，溶氧20%以上，当葡萄糖耗完后，按照5g/Lh的速率流加葡萄糖，培养至发酵结束。
[0042]经检测，70小时后，发酵液中羟脯氨酸浓度可达28.8g/L，L_脯氨酸浓度为2.4g/L。
[0043]实施例5-6所构建的大肠杆菌菌株经过发酵后，可以得到高浓度的羟脯氨酸产品，同时副产物少，相比现有技术水平，优势明显，具备了工业化的潜力。
【主权项】
1.一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，经鉴定为大肠杆菌HJ(Escherichia coli HJ)，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月17日，保藏编号为CCTCC NO: Μ 2015550。2.根据权利要求1所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，其特征在于:所述重组菌株是由L-脯氨酸羟化酶基因，野生型L-谷氨酸激酶基因、L-谷氨酰磷酸还原酶基因和抗性基因分别克隆到表达载体上，前端加上强启动子，然后设计包含了同源臂的长引物将表达框扩增出来，利用RED重组技术一次性将其整合到大肠杆菌基因组的L-脯氨酸脱氢酶基因位点得到的。3.根据权利要求2所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，其特征在于:所述L-谷氨酸激酶基因和L-谷氨酰磷酸还原酶基因来源于大肠杆菌，分别由proB和proA基因编码。4.根据权利要求2所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，其特征在于:所述L-脯氨酸羟化酶来源于胞囊菌，由proH基因编码。5.根据权利要求2所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，其特征在于:所述抗性基因为卡那霉素抗性基因。6.根据权利要求2所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，其特征在于:所述强启动子来源于枯草芽孢杆菌的木聚糖酶基因启动子。7.—种如权利要求1?6任一权利要求所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株的构建方法，其特征在于，通过将L-脯氨酸羟化酶基因，野生型L-谷氨酸激酶基因、L-谷氨酰磷酸还原酶基因和抗性基因分别克隆到表达载体上，前端加上强启动子，然后设计包含了同源臂的长引物将表达框扩增出来，利用RED重组技术一次性将其整合到大肠杆菌基因组的L-脯氨酸脱氢酶基因位点。8.根据权利要求7所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)L-脯氨酸羟化酶基因及其启动子的克隆:根据NCBI数据库中GenBank:D78338.1设计L-脯氨酸羟化酶基因proH序列，如SEQ ID NO: 1所示，和枯草芽孢杆菌的木聚糖酶基因启动子Pxyl序列，如SEQ ID N0:2所示，将二者拼接到一起，两端分别加上EcoRI和KpnI位点，基因合成整个片段Pxyl+proH，SEQ ID N0:3所示;然后利用基因克隆技术将Pxyl+proH片段克隆到pUC18载体的EcoRI和ΚρηΙ位点处，得到pUC18-pxyl-proH; (2)L-谷氨酸激酶基因proB和L-谷氨酰磷酸还原酶基因proA基因的克隆:设计引物对，F-proB，如SEQ ID NO:4所示和R-proA，如SEQ ID NO: 5所示，分别增加ΚρηΙ和BamH位点，从大肠杆菌基因组中扩增proB+proA两个基因及其上下游各一小段的DNA片段;然后利用基因克隆技术将proB+proA片段克隆到pUC18-pxyl-proH的ΚρηΙ和BamHI位点处，得到重组质粒pUCl8-pxy1-proH-proB-proA； (3)卡那霉素抗性基因的克隆:设计引物对，F-kanR，如SEQID NO:6所示和R-kanR，如SEQ ID NO: 7所示，分别增加BamH和Hindi 11位点，从模板质粒pKD4上扩增卡那霉素抗性片段kanR;然后利用基因克隆技术将kanR片段克隆到pUC18-pxyl-proH-proB_proA的BamHI和Hindlll位点，得到重组质粒pUC18-pxyl-proH-proB-proA_kanR; (4)四个表达框的整合:根据大肠杆菌W3110的putA序列设计两条长引物，F-putA，见SEQ ID N0.8所示和R-putA，见SEQ ID N0.9所示，末端分别与待敲除的putA序列同源，然后以重组质粒口1^18117111'0!111'01311'04-1^111?为模板，经？0財广增得到含有proH、proB、proA和kanR四个表达框的DNA片段，利用RED重组技术整合到大肠杆菌W3110基因组的putA位点。9.根据权利要求1?6任一权利要求所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株在发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用，其特征在于，以葡萄糖为主碳源，通过好氧发酵合成高浓度反式-4-羟基-L-脯氨酸。10.根据权利要求9所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株在发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用，其特征在于，所述好氧发酵条件为培养温度33?37度，控制pH为6.8?7.0，溶氧20%以上，发酵时间60?70小时。
【专利摘要】本发明涉及一株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株及其构建与应用,属于基因工程技术领域。一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，经鉴定为大肠杆菌？HJ（Escherichia？coli？HJ），保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月17日，保藏编号为CCTCC？NO:？M？2015550。本发明选择受反馈调节控制的野生型谷氨酸激酶加强表达，同时将三个要表达的基因连同相关的启动子等表达元件整合到大肠杆菌染色体上，使其可以随着染色体的复制而不断复制，保持了极高的遗传稳定性，克服了质粒丢失的问题，从而延长了有效发酵周期，增加了羟脯氨酸的产量。CCTCC NO：M201555020150917
【IPC分类】C12N15/70, C12R1/19, C12N1/21, C12P13/24
【公开号】CN105483069
【申请号】CN201510899127
【发明人】储消和, 吴黎诚, 程跃, 生英涛, 徐顺清, 陈万河
【申请人】浙江绿创生物科技有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月9日