鲜等。
【附图说明】
[0032] 图1重组质粒上游和下游同源臂重叠 PCR连接产物连接PMD-19T载体，重组质粒的 PCR验证图。
[0033] 图2B.subtilis PB2-LC1 产[ACl]Plipastatin抗菌脂肤（图2a)W及Plipas化tin 标样的ESI-MS图（图化）。
[0034] 图3B.subtilisPB2-LCl产[ΔCl]Plipastatin抗菌脂肤m/z100 8.5870作为前导 子的图谱及其分子结构与离子碎片分析图。
[0035] 图4B.subtilis PB2-LC1 产[ACl]Plipastatin抗菌脂肤化学结构式（图4a)及 Plipastatin抗菌脂肤化学结构（图4b)。
[0036] 图5B.subtilis PB2-LC1 产[ACl]Plipastatin抗菌脂肤的抑菌图谱；
[0037] 1:菌株 B.subtilis PB2-L 提取物，2:菌株 B.subtilis PB2-LC1 提取物;A:点青霉 (Penicillium notatum AS3.4356)，B:桃软腐病菌（Miizopus stolonifer AS 3.2336)，C: 大肠杆菌化 scherichia coli ASl.487)，D:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus AS1.2465)。
[0038] 生物材料保藏信息：
[0039] PB2-L，分类命名为枯草芽抱杆菌Bacillus subtil is,保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微 生物研究所，保藏日期为2015年11月23日，保藏编号为CGMCC NO. 11723。
【具体实施方式】
[0040] W下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0041 ]实施例1: W枯草芽抱杆菌B.subtilis PB2-L为出发菌株的产新型抗菌脂肤[Δ Cl]Plipastatin菌株B.subtilis PB2-LC1 的构建。
[0042] 1材料与方法
[00创 1.1材料
[0044] 1.1.1菌株、质粒
[0045] Escherichia coli D册α购于Invi;rtogen公司，B.subtilis PB2-L菌株保存于中 国普通微生物菌种保藏管理中屯、（CGMCC)，保存号：CGMCC NO. 11723，溫敏型质粒地S2全序 列如SEQ ID N0.1所示，源于W下参考文献:杨慧林，王坤，等.解淀粉芽抱杆菌ptsGHI基因 的敲除及缺陷株生长特性[J].华南理工大学学报，2012，40，95-100。
[0046] 1.1.2主要试剂和仪器
[0047] 限制性内切酶、T4DNA连接酶和PMD-19T载体购自TaKaRa公司；抗生素氨节青霉素 (Amp)、卡那霉素化an)和红霉素化rm)购自北京普博欣生物科技有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒和pfu高保真PCR酶购自生工(上海)生物科技有限公司；质粒小提试剂盒和胶回 收试剂盒购自生工(上海)生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯.
[004引1.1.3培养基及培养条件
[0049] LB培养基：蛋白腺lOg，酵母粉5g，氯化钢lOg，补水至化;种子液体培养基：牛肉浸 膏5.0g，蛋白腺lO.Og，酵母膏5.0g，化C15.0g，葡萄糖lO.Og，抑7.0,补水至1L。基础发酵培 养基：葡萄糖40 . Og，レ谷氨酸钢 14 . Og，MgS〇4〇 . 5g，KC1 0.5g，KH2PO41.0 g，FeS〇4 · 7出0 0.15mg，MnS〇45.0mg，CuS〇4 · 5出0 0.16111旨，口职.0，补水至化。葡萄糖分别灭菌。大肠杆菌用 LB培养基培养，除含有溫敏型质粒的大肠杆菌要置于30°C下培养外，其它均于37°C下培养. [0化0] 1.1.4引物
[0化1] 针对NCBI上关于Plipastatin C和D亚基公布的基因序列，利用Primer Premier 5 软件进行引物设计，设计引物如下：
[0化2]
[0053] 1.2 方法
[0化4] 1.2.1 B.subtilis PB2-L菌株总DM的提取
[0055]用生工(上海)生物公司细菌基因组提取试剂盒提取。
[0化6] 1.2.2 PMD-19T-AC1重组质粒的构建
[0057] WB.subtilis PB2-L基因组DNA为模板，WSEQ ID N0.2所示的5'ppsC-D-ΔCl (ClaI)-F和SEQIDN0.3所示的3'ppsC-D-ΔCl-S0E-R为引物进行PlipastatinC和D亚基 基因的上游同源臂PCR扩增；W沈QIDN0.4所示的5'ppsC-D-ΔCl-S0E-F和沈QIDN0.5所 示的3/ppsC-D-ACUKpnI)-R为引物进行下游同源臂PCR扩增，PCR扩增条件为：50化体系， 94°C 预变性 3min，94°C 变性 30s，55°C 复性 30s，72°C 延伸 3〇3,30个循环，72°(3延伸1〇111111，将 获得的基因片段进行凝胶回收;取等摩尔体积的上游和下游同源臂扩增产物作为模板进行 PCR扩增，所用的正向引物和反向引物分别为：SEQ ID N0.2所示的5/ppsC-D-ΔCl(ClaI)-F 和沈QIDN0.5所示的3'ppsC-D-ΔCUKpnI)-R，获得融合的PlipastatinC和D亚基基因上 游和下游同源臂片段;将上述获得的融合的Plipas化tin C和D亚基基因上游和下游同源臂 片段与PMD-19T载体链接，连接产物转化Escherichia coli D册α，挑取单菌落，接种于含终 浓度为lOOmg/mL氨节霉素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，菌液经PCR扩增，筛选阳性克 隆，进行重组质粒的双酶切鉴定，W及测序，得到含有Plipas化tin C和D亚基基因上游和下 游同源臂的PMD-19T-AC1质粒；
[0化引1.2.3溫敏型质粒地S2重组载体的制备
[0059] 将溫敏型质粒地S2用Clal和ΚρηΙ双酶切，Cla巧日ΚρηΙ双酶切PMD-19T-AC1质粒， 用胶回收试剂盒纯化，WT4DNA连接酶连接，转化Escherichia coli D册α，得到阳性转化 子，成功构建融合质粒地S2-AC1。
[0060] 1.2.4目的菌株的获得
[0061 ] 将构建好的融合质粒地S2-AC1转化B.subtilis PB2-L菌株，通过同源重组的方 法整合到B . subtilis PB2-L菌株的基因组上，转化方法参照W下文献记载Zakataeva, Natalia P Nikitina,Oksana V et.al.A simple method to introduce marker-free genetic modifications into the chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains[J].Applied microbiology and biotechnology. 2010,85，1201-1209,? 沈Q ID NO. 6所示的 5'PKS-1058-ERM-F和沈Q ID NO. 7所示的5/ PKS-1058-ERM-R为引物PCR扩增，验证得到的阳性转化子，通过同源重组的方 法得到新的菌株B.subtilis PB2-LC1。
[0062] 实施例2
[0063] 1本发明枯草芽抱杆菌PB2-LC1产[ACl]Plipastatin的发酵和分离鉴定方法如 下：
[0064] 1.1产脂肤的发酵培养
[0065] 将试管斜面B. subtilis PB2-LC1菌种接种于装有种子培养基(营养琼脂培养基去 除琼脂）的Ξ角瓶中，37°C、130-150r/min下培养24h，至对数生长期，制成浓度为10 8-109CFU/L的种子液。将上述制备的B. subtilis PB2-LC1种子液W3-5%浓度接种于Landy发 酵培养基中，于33°C、180r/min下培养72h，得抗菌物质发酵液。
[0066] 取上述制备的发酵液在SOOOr/min下离屯、25min除去菌体，上清液调抑至2.0,低溫 过夜，500化/min离屯、20min取沉淀用甲醇溶解，调节抑至7.0，于磁力揽拌器上低溫揽拌化， 100(K)r/min离屯、20min后得到的上清液即为含脂肤的提取物。
[0067] 1.2产脂肤的高效液相色谱分析化PLC)
[0068] [ACl]P1 ipastatin的高效液相色谱检测条件:色谱柱为Agilent C18柱，4.6mmX 250mmX 0.5皿;进样量柱溫35°C;检测波长214nm;流速0.80ml/min;检测时间70min。 溶剂:A相为含1%〇Ξ氣乙酸的纯净水，B相为含1%〇Ξ氣乙酸的乙腊;梯度变化条件如表1所 示。HPLC结果显示：[ACl]Plipastatin的HPLC洗脱保留时间分别约为31~35min。
[0069] 表1 [ACl]Plipastatin检测时的流动相
[0070]
[0071 ] 1.3新型抗菌脂肤的LC-MS鉴定
[0072] 液质联用化C-MS)实验:质谱实验的基本原理是使所研究的物质形成离子，然后使 所形成的离子按质荷比m/z(mass-ch;wge ratio)进行分离。利用质谱与高效液相联用，可 W定性、定量分析物质的组成。采用液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振高分辨质谱仪化C-FTICR-MS)测定样品的分子量，条件如下：
[0073] 液相色谱条件
[0074] a)质谱柱：C18-MS-n2.6mm〇 X250mm，TSK;
[007引 6)柱溫：25。。
[0076] (3)进样体积:5叫1;
[0077] 流动相为均含1%〇Ξ氣乙酸的水(A)和乙腊(B)，流速为0.2ml/min，梯度洗脱条件 为：0-20min，B 5-95% ;20-