-甲基吗嘟]。
[0120] 使用在20%DMF中的赃晚溶液W移除化OC。为了从残基上移除保护基或者将合成 的肤从树脂上分离，使用了切割混合物[TFA (Ξ氣乙酸)/TIS (Ξ异丙基硅烷)/H20 = 92.5/ 2.5/2.5]〇
[0121] 每个肤的合成通过使用固相支架W结合至具有氨基酸保护基的起始氨基酸，分别 使对应的氨基酸反应，用溶剂冲洗和脱保护，并重复此过程。
[0122] 在从树脂释放之上，合成的肤通过册LC纯化，通过质谱验证，冻干，通过MS来验证 合成，然后冻干。
[0123] 阳P 1的具体合成过程可W如下：
[0124] 1)偶联
[0125] 用NH2-Leu-2-氯Ξ苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量）与融化于DMF中的偶联试剂 皿TU(8当量)/册化(8当量)/NMM(16当量)一起混合，并在室溫(RT)溫育2小时。溫育后，反应 混合物依次用DMF、MeOH和DM巧中洗。
[0126] 2)Fmoc 去保护
[0127] 添加在20%DMF中的赃晚溶液并在RT溫育5分钟，进行2次，然后依次用DMF、MeOH和 DM巧中洗。
[0128] 3)通过重复上述的反应1)和2)来制造肤的基本框架，ΝΗ2-Ν(?Υ〇-Κ(Ρ6?·)-6-Ρ-Κ (Boc) -A-G-R (Pbf) -Ν( Tr t) -M-R( Pbf) -R (饥f) -Κ (Boc) A-F-G-VA-R (Boc) Α-2-氯Ξ苯甲 基树脂。
[0129] 4)切割：向完成合成的肤添加切割混合物，W此从树脂上切下肤。
[0130] 5)将预冷的乙酸添加至获得的混合物中，然后离屯、W使收集的肤沉淀。
[0131 ] 6)在通过Prep-HPLC纯化后，通过LC/MS确认分子量，并且冻干W制造成粉末形式。
[0132] 所述制备方法基于阳P98,而阳P1通过与阳P98相同的方法制备。
[0133] II.细胞穿透肤的细胞内运输
[0134] 实施例2:阳P98的细胞内运输的分析
[0135] (1)细胞系培养
[0136] 为了分析细胞内运输，使用了韩国头颈癌细胞（SNU-1041，SNU-1076)、由 MDAnderson癌症中屯、发现的头颈癌细胞(0SC19，HN5)和正常细胞DPSC(牙髓干细胞）。
[0137] 通过将每个细胞接种在具有RPMI-1640或DMEM培养基、10%FBS和抗菌-抗真菌抗 生素的100cm2培养皿中于培养箱(37°C，5 % C〇2)中培养。通过检测生长速度和细胞条件，每 2-5天传代细胞，使细胞保持良好的状态。
[0138] (2)通过流式细胞术分析在头颈瘤细胞中的细胞内运输
[0139] 在提前用制备的癌细胞在6孔板W60%-70%水平培养24小时后，分别用FITCQ化 M)、pepl-F口C( ΙΟμΜ)、FITC-TAT( ΙΟμΜ)处理，2.5小时后去除培养基，用盐水冲洗，通过膜 酶-EDTA酶分离细胞，制得每管106个细胞/ml,细胞用FACS分析。
[0140] 在检查结果后，在阳P98或阳P1与FITC的綴合物的情形中，表现出比仅用FITC得到 提高的细胞穿透性。
[0141] 同时，对于表现出更低的细胞穿透性的诸如HN5和0SC19等头颈癌细胞，确认了 P巧98-門TC的细胞穿透性比对照组和pepl-門TC高100倍至200倍。
[0142] 同时，对于表现出pep 1高细胞穿透性的诸如SNU-104U用41标记)和SNU-1076(用 76标记)等头颈癌细胞，P巧98-門TC表现出与pepl-門TC相同的细胞穿透性(见图2)。
[0143] 所述结果表明，结合P邱98的缀合物总是表现出高细胞穿透性，pep98的细胞穿透 性可透过缀合物起作用，并且可W通过其和作为活性成分的抗癌药物缀合而找到减少抗癌 治疗副作用和增加抗癌治疗的功效的方法。
[0144] III.抗癌药物和细胞穿透肤的缀合物的制备
[0145] 实施例3:STAT3抑制剂(NSC 74859)和细胞穿透肤(pep98)的缀合物的制备
[0146] (1)偶联用pep98肤树脂基本框架的制备
[0147] 对于偶联，用NH2-氨基-2-氯Ξ苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量)和偶联试剂皿TU (8当量)/HCm(8当量)/NMM(16当量)在溶解到DMF中后添加到氨基酸，将溶液在室溫活化2 小时，然后依次用DMF、MeOH和DM巧中洗。
[0148] 此后，为了将化OC脱保护，进行了添加在20%DMF中的赃晚溶液的步骤、在室溫活 化2次每次5分钟的步骤、和依次用DMF、MeOH和DM巧中洗的步骤。
[0149] 通过重复上述步骤，制得肤P邱98的基本框架（畑2-則1'的）-1?。6門-6斗-1((8〇(3)-A-G-R (Pbf) -N( ht) -M-R (Pbf) -R (Pbf) -K (Boc) A-F-G-VA-R (Boc) A-2-氯Ξ苯甲基树脂。
[01加](2)与STAT3抑制剂(NSC74859)的偶联：
[0151] NSC 74859(Sigma Aldrich,目录号SML0330,4当量）和偶联试剂册TU(4当量）/ 册化(4当量)/NMM(8当量)在溶解至化MF中后添加到pep98上；溶液在室溫活化2小时;然后， 依次用DMF、MeOH和DM巧中洗。
[0152] 添加 TFA/TIS/肥0 = 95/2.5/2.5至合成完成的树脂，然后将所述肤从树脂上分离。
[0153] 在用HPLC纯化后，所述肤被冻干并且通过MS确认。
[0154] 实施例4:细胞穿透肤(pep98)和紫杉醇的缀合物的制备
[0155] (1)引入了马来酷亚胺的紫杉醇的合成
[0156] 对于P邱98和紫杉醇(Sigma-Al化ich Inc.，St Louis,美国）的缀合，将接头(4-马 来酷亚胺基下酸）引入紫杉醇，并将琉基反应性官能团引入紫杉醇。
[0157] 将紫杉醇lg(l. 17mmol，1当量）、4-马来酷亚胺基下酸210mg(l. 17mmol，1当量）、二 甲基氨基化晚(014?)140111邑(2.34111111〇1，2当量），二环己基碳二亚胺(0〇：)480111邑（1.17111111〇1，1 当量)添加至100ml圆形烧瓶中，然后添加二氯甲烧50ml。所有的成分在室溫揽拌反应。
[0158] 反应通过化C(薄层色谱法)检测，然后在反应结束后，添加50ml蒸馈水(DW)并进行 后处理(Rf值= 0.43,己烧：乙酸乙醋= 1:1)。
[0159] 在收集有机层和通过硫化儀去除水分后，所述有机层通过硅胶柱层析(己烧：乙酸 乙醋= 1:1)分离。从硅胶柱层析获得的物质进行浓缩，获得引入有马来酷亚胺的紫杉醇。
[0160] (2)琉基修饰的pep 98(琉基乙酷基-Ahx-NRGFKAGRNMRRKLFGVLRL)的合成
[0161] SEQ ID NO: UPEP98)的肤根据固相肤合成的传统已知方法合成。更具体地，利用 ASP48S(P邱tron, Inc. , Dae jeon R0K)，通过Fmoc固相肤合成（SPPS)从C端偶联每个氨基酸 来合成所述肤。如下使用其第一个氨基酸在C端连接到树脂的那些肤：
[0162] (N肥-Leu-2-氯Ξ苯甲基树脂）
[0163] 用W合成肤的所有氨基酸在N端通过化OC保护，所述氨基酸残基通过能溶解在酸 中的T;rt、Boc、t-Bu、Pbf等保护。实例包括W下：
[0164] 化〇(；-43]1(化1:)-(^、化〇(3-41日-0山化〇(3-4巧。6;1^ )-0山化〇(3斗116-0山化〇(3-1^611-0山尸111〇。-1^73(13〇。）-0山尸1]1〇。-]\161：-0山尸1]1〇。-617-細、尸1]1〇。-￥日1-0山尸1]1〇。-411又-(^(411又=6-氨 基己酸，Fmoc-Ahx-OH被用来合成肤）。
[0165] 作为偶联试剂，使用了皿TU[2-(1H-苯并Ξ挫-1-基)-1，1，3,3-四甲基脈六氣憐酸 醋]/册Bt [ N-径基苯并Ξ挫]/NMM[ 4-甲基吗嘟]。
[0166] 使用在20%DMF中的赃晚溶液W移除化OC。为了从残基上移除保护基或者将合成 的肤从树脂上分离，使用了切割混合物[TFA(S氣乙酸)/抓T(乙二硫醇)/TIS(S异丙基娃 烧)/肥 0 = 92.5/2.5/2.5/2.5]。
[0167] 每个肤的合成通过使用固相支架W结合至具有氨基酸保护基的起始氨基酸，分别 使对应的氨基酸反应，用溶剂冲洗和脱保护，并重复此过程。
[0168] 在从树脂释放之上，合成的肤通过册LC纯化，通过质谱验证，冻干，通过MS来验证 合成，然后冻干。
[0169] 通过高效液相色谱发现所制备的肤的纯度为95% W上。
[0170] 具体合成过程可W如下：
[0171] 1)偶联
[0172] 用NH2-Leu-2-氯Ξ苯甲基树脂保护的氨基酸(8当量）与融化于DMF中的偶联试剂 皿TU(8当量)/册化(8当量)/NMM(16当量)一起混合，并在室溫(RT)溫育2小时。溫育后，反应 混合物依次用DMF、MeOH和DM巧中洗。
[0173] 2)Fmoc 脱保护
[0174] 添加在20%DMF中的赃晚溶液并在RT溫育5分钟，进行2次，然后依次用DMF、MeOH和 DM巧中洗。
[0175] 3)通过重复上述的反应1)和2)来制造肤的基本框架，TYt-琉基乙酷基-Ahx-N (Tr t) -R (饥f) -G-F-K (Boc) -A-G-R (Pbf) -N (Tr t) -M-R (Pbf) -R (饥f) -K (Boc) -kF-G-V-kR (Boc) A-2-氯Ξ苯甲基树脂。
[0176] 4)切割：向完成合成的肤添加切割混合物，W此从树脂上切下肤。
[0177] 5)将预冷的乙酸添加至获得的混合物中，然后离屯、W使收集的肤沉淀。
[0178] 6)在通过Prep-HPLC纯化后，通过LC/MS确认分子量，并且冻干W制造成粉末形式。
[0179] (3)引入有马来酷亚胺的紫杉醇和琉基修饰的pep98的缀合物的合成
[0180] 1)将合成的引入有马来酷亚胺的紫杉醇