一种通过敲除其他代谢途径进而提高反式-4-羟脯氨酸产量的生物合成方法
【技术领域】
[0001 ] -种通过敲除其他代谢途径进而提高反式-4-径脯氨酸产量的生物合成方法，属 于微生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 径基-k脯氨酸（简称：径脯氨酸，Hy化oxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是k脯氨酸 径基化后的产物，根据其径基化位置的不同，可分为3-径脯氨酸(3-Hyp)或4-径脯氨酸(4- Hyp)。径脯氨酸化y化oxyproline，Hyp)是胶原蛋白的主要组成成分，不属于20种常见的氨 基酸。
[0003] 近些年来，Hyp的研究和开发已经引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关 注。它可W作为化妆品添加剂，具有抗氧化、抗福射的作用;它具有减肥作用，可望成为比较 理想的减肥药物;具有多种生理功能与独特的生物活性，既可作为各种软组织疾病的药物， 如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，W及治疗各种皮肤疾病;作为氨基 酸注射液的重要组分，它对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效;它参与脂肪的 乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成，具有调节脂肪乳化等作用；它还是多种药物，如第Ξ 代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。
[0004] 目前，生产径脯氨酸的方法有化学合成法、生物组织提取法W及生物合成法。化学 合成方法合成步骤较多，成本高，不适合工业生产。而生物组织提取法利用动物蛋白来源如 明胶、猪皮为原料，经酸、碱或蛋白水解酶水解后提取径脯氨酸，该法纯化步骤长，成本高， 浪费大量原料，且废弃物污染严重，很容易被市场淘汰。随着DNA重组技术的发展W及微生 物资源的发现，生物合成酶法生产径脯氨酸成为工业上很有前景的生产方法。
[0005] 生物合成法能将游离的心脯氨酸通过脯氨酸径化酶的催化，转化为径基-1^-脯氨 酸，但在生物细胞中，游离的脯氨酸也是一种可W被利用的碳源，其积累量比较有限，所W 有必要切断生物细胞内与心脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径，使得心脯氨酸得 到大量积累，进而更多的转化为径基脯氨酸，提高径基脯氨酸产量。
[0006] 本发明所提供的切断分支代谢途径进而提高提高径基A-脯氨酸产量的生物合成 方法，具有重要的工业应用价值。
【发明内容】
[0007] 针对生物合成法生产径基-心脯氨酸时，需外源添加レ脯氨酸导致生产成本较高 的缺点，本发明的目的是提供一种通过提高底物k脯氨酸积累量进而提高径基脯氨酸 产量的生物合成方法。
[000引本发明是一种通过提高底物k脯氨酸积累量进而提高径基脯氨酸产量的生物 合成方法。其特征是:切断生物细胞内与心脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径，使 得心脯氨酸得到大量积累，进而更多的转化为径基脯氨酸，提高径基脯氨酸产量。
[0009] 本发明所述重组细胞的构建方法：
[0010] 1.含有脯氨酸径化酶基因的载体的构建
[0011] 根据大肠杆菌密码子的偏好性，利用密码子的简并性在不改变氨基酸序列的基础 上，消除低使用率的密码子，优化脯氨酸径化酶基因，使得其更有利于在大肠杆菌中得到表 达。同时，选用色氨酸串联启动子作为其启动子，对其进行优化，使得径化酶基因得到更为 高效的表达。
[0012] 2.通过敲除基因 argB切断生物细胞内与心脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的精氨酸 代谢途径
[0013] 谷氨酸起始的下游代谢主要包括脯氨酸、谷氨酷胺和精氨酸3个途径。在精氨酸合 成途径中，Ξ簇酸循环代谢支路生成的谷氨酸不仅是精氨酸合成的前体，而且还是脯氨酸 合成的前体，脯氨酸与精氨酸的合成形成竞争关系。因此，切断精氨酸合成支路有利于细菌 体内代谢流向脯氨酸合成方向。
[0014] ar浊编码的乙酷谷氨酸激酶NAGK是精氨酸生物合成一个关键酶，其受到精氨酸的 反馈抑制和反馈阻遏。乙酷谷氨酸激酶(N-acetパ-レglutamatekinase，NAGK)是氨基酸激 酶家族酶系之一，利用ATP催化乙酷谷氨酸(N-acetyl-レglutamate，NAG)的丫-COO群组憐 酸化生成无水酷基憐酸盐，且运个过程具有可逆性。
[0015] 敲除argB基因，可W有效的打断细胞内由谷氨酸生成精氨酸的途径，从而积累更 多的k脯氨酸，有利于径脯氨酸的产生。
[0016] 3.重组大肠杆菌的发酵实验
[0017] 35°C、220 巧 m 培养 24h，包括重组菌株化 21(DE3)ΔputA/ΔargB(pUC19-ptrp2- Hyp-V 冊 ） ，取发酵液测定反式-4-径 脯氨酸的含量。
【附图说明】
[0018] 图1.精氨酸和脯氨酸代谢途径。
[0019 ]图2.径脯氨酸在大肠杆菌细胞中的生物转化途径。
[0020] 图3.表达质粒pUC19-pt巧2-Hyp-V冊图谱。
[0021] 图 4.重组菌株 BL21(DE3)AputA/Aar 浊(pUC19-pt 巧 2-Hyp-V 冊）的获得。
【具体实施方式】
[0022] LB培养基：1 % (W/V)膜蛋白腺，0.5 % (W/V)酵母抽提物，1 % (W/V)化C1，pH 7.0- 7.2。
[0023] Amp(Kan)抗性平板：1 % (W/V)膜蛋白腺，0.5% (W/V)酵母抽提物，1% (W/V)化Cl， 1.5% (W/V)琼脂糖，氨节青霉素(卡那霉素)50yg/mL。
[0024] 5XKCM(大肠杆菌转化缓冲液）：0.5MKCl，0.15MCaCl2,0.化MMgCl2。
[0025] 反式-4-?脯氨酸的定量测定:将发酵液离屯、后，取上清，稀释到2.5mL后加于lOmL 试管中，之后加入1血氯胺T(氯胺T溶液:将1.41 g氯胺T溶于10血水中，依次加入1 OmL正丙醇 和80mL缓冲溶液，其中缓冲溶液配方为:将50g巧樣酸，26.3g化0H和146. Ig结晶乙酸钢溶 于水至1L，然后与200mL水W及300mL正丙醇混合），摇匀后在室溫中放置20min，然后加入 ImL显色剂（显色剂：称取lOg对二甲氨基苯甲醒，用35mL高氯酸溶解，缓慢加入65mL异丙 醇），摇匀后迅速将试管移至60°C水浴锅中，保溫20min，再用冷水冷却，最后用紫外分光光 度计在560nm波长处测定吸光值。
[00%] 实施例1 :a;r浊基因敲除
[0027]由NCBI获得ar浊的基因序列（GenBa址:M946981.2):ar浊基因 （SEQ ID N0:1)
[002引采用短同源臂，设计引物对：引物5'-3':P1(SEQ ID N0:2)、P2(SEQ ID N0:3)
[0029] W地D4为模板，获得含有argB上下游同源臂和抗性基因化an)的打祀片段。通过化 学转化法获得含有质粒地D46的大肠杆菌化21(DE3)AputA，之后将其制备为电转感受态， 利用电转仪将打祀片段导入到电转感受态中，在质粒地D46表达的Ξ个蛋白的作用下，利用 Red重组系统完成基因重组。电转后，30°C复苏化，涂布含有卡那霉素的平板。之后转入质粒 PCP20,用于消除抗性基因，将菌株分别点种于无抗性、Amp抗性平板、Kan抗性平板，选择只 在无抗性平板上生长的单菌落。利用引物对Y1:(SEQ ID N0:4)和Y2:(SEQ ID N0:5)进行菌 落PCR验证基因是否敲除，从而获得敲除基因 argB缺失型的菌株--化21 (0Ε3)Δριι?Α/Δ 过 rgBc
[0030] 实施例2:重组质粒(pUC19-pt巧2-Hyp-V冊）的获得
[0031] 取实验室保存的含有目的质粒的菌株活化，于37°C，220rpm培养12-16小时。取培 养后的菌液提取质粒，所有操作均严格按照说明书进行。
[0032] 实施例3:重组菌株的构建
[0033] 取出大肠杆菌BL21 (DE3) AputA/AargB感受态，置于冰上解冻后，加入37化的无 菌水，1化L KCM，3化质粒。混匀后，置于冰上30min，42°C热激90s，再放置冰上5min，加入600 化新鲜的LB培养基，37°C振荡培养化，取1(Κ)化涂布于氨节抗性平板。37°C培养8-16h后，待 长出单菌落，挑取单菌落验证。
[0034] 实施例4:重组菌株的发酵实验
[0035] 摇瓶培养:挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基(含氨节青霉素50yg/ mU中，37°C、220巧m培养化后，按6 % (V/V)接种量接入含有30血发酵培养基[0.8 % (W/V)葡 萄糖，1%(W/V)甘油，0.8%(W/V)玉米浆，1.3%(W/V)硫酸锭，0.15%(W/V)憐酸氨二钟， 0.2 % (W/V)氯化钢，4mM硫酸亚铁，0.3g/L硫酸儀，0.015g/L氯化巧，pH 8.0 ]的250mL摇瓶 中，在旋转式摇床中35°C、220rpm培养24h，取发酵液检测反式-4-径脯氨酸浓度。反式-4-径 脯氨酸的测定方法详见实施方式一般性说明。发酵结果显示，反式-4-径脯氨酸产量达到 921mg/L〇
【主权项】
1. 一种有效提高羟脯氨酸产量的生物合成方法，其特征在于，在生物细胞利用L-脯氨 酸生产羟基-L-脯氨酸的过程中，通过切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的 其他代谢途径，来提高底物脯氨酸的量进而达到提高羟基-L-脯氨酸的产量。2. 如权利要求1所述，利用生物细胞生产羟基-L-脯氨酸的过程是指，生物细胞利用外 源添加或者自身积累的脯氨酸，在脯氨酸羟化酶、酮戊二酸和亚铁离子存在的情况下，将 游离的L-脯氨酸转化为羟基-L-脯氨酸。3. 如权利要求1所述，切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途 径的方法:包括生物细胞内与其他代谢途径的相关酶不能被表达或者不能行使功能的方 法，如基因敲除、RNA干扰等。4. 如权利要求1和2所述，生物细胞包括任何能够表达脯氨酸羟化酶，自主产生α-酮戊 二酸，将脯氨酸转化为羟基-L-脯氨酸的有机体，包括大肠杆菌、嗜乙酸棒杆菌、酵母、动植 物细胞等。
【专利摘要】本发明公开了一种有效提高羟脯氨酸产量的生物合成方法。其中，生物合成法生产羟基-L-脯氨酸的系统是指，在生物细胞内生物体在α-酮戊二酸及亚铁离子存在的情况下利用脯氨酸羟化酶，将游离的L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法。提高羟脯氨酸产量的方法为：切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径。其中，其他代谢途径是指，精氨酸代谢途径。通过使用这种方法，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达到921mg/L。
【IPC分类】C12P13/24
【公开号】CN105543303
【申请号】CN201610035648
【发明人】张震宇, 王晓姣, 姚动邦, 黄建华, 魏照辉
【申请人】江南大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月19日