靶向h7流感病毒上中和表位的单克隆抗体的制作方法
【专利说明】革田向H7流感病毒上中和表位的单克隆抗体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本发明申请设及并要求2012年11月19日提请的美国临时专利申请系列号61/727， 927的优先权。运个申请通过引用并入本文。
[0003] 序列提交
[0004] 本申请和电子版的序列表一起提交。该序列表命名为 2577226PCTSequenceListing.txt ,2013年8月9日创建，大小为13化。序列表电子版的信息 W其全部内容通过引用并入本文。
[0005] 发明背景
[0006] 本发明设及鼠单克隆抗体(mAb)llB9和mAb 62及其活性片段，其均祀向甲型流感 H7血凝素的主要中和表位。本发明还设及使用鼠 mAb llB9、mAb 62或其片段预防和治疗H7 流感的方法和组合物。本发明进一步设及确定、鉴别和/或定量(a)样品或疫苗中甲型流感 血凝素或者(b)针对甲型流感血凝素的抗体的方法和试剂盒。
[0007] 本文中用于阐明本发明背景或者提供关于实践的另外的详细描述的出版物及其 它材料通过引用并入，方便起见归类在参考文献中。
[0008] 高致病性禽流感（HPAI)H7亚型在禽类中的发生持续是关注的公共卫生问题 (化化ao et al.，2008;Abbas et曰1.，2011)。2002年W来，来自欧亚和北美谱系的甲型流 感H7亚型病毒在荷兰、意大利、加拿大、英国和美国已经导致100例W上的人感染。在2003 年，HPAI H7N7在荷兰爆发，与感染禽类密切接触的89人感染，并导致1人死亡。运些情况包 括2003年荷兰HPAI H7N7病毒的爆发，导致超过80例人感染及1人死亡;HPAI H7N3病毒在 2004年在加拿大英属哥伦比亚导致2例结膜炎;在2007年英国一群人感染低致病性禽流感 化PAI )H7N2病毒，导致几例流感样疾病和结膜炎;及在2003年在纽约的1例呼吸道感染。H7 亚型病毒已经呈现出显著的大流行可能(Min et al. ,2010)。
[0009] 人对于H7禽流感病毒是免疫学天然的，循环于欧亚和北美的家禽和野禽中的LPAI H7亚型病毒具有进化和获得高致病性表型的潜力，通过积累突变或者通过在血凝素(HA)裂 解位点重组导致在禽类中是毒性基序的高度可裂解的HA。近年来的研究也提示在2002- 2003年分离的现时北美谱系H7亚型病毒部分适于识别2-6-连接的唾液酸，其是人流感病毒 的优选受体及优先在人上呼吸道中发现(Gambaryan et al. ,2012)。此外，H7禽流感病毒与 人流感病毒包括季节性H1N1和H3N2及流行性H1N1病毒之间RNA基因组的共感染和遗传重 配，可导致在人群中有效传递并导致流行的重配病毒的产生。家禽可作为重要的中间宿主 将野生禽流感病毒传递至人，猪也可W，如在2009年世界范围内流行性H1N1流感病毒的猪 源人感染感染所证明。
[0010] 使用单克隆抗体的被动免疫被认为是治疗许多感染性疾病的切实可行的选项。目 前已经有许多使用流感病毒HA1蛋白的中和抗体的治疗方法(Prabakaran et al. ,2009)。 运种蛋白易于祀向，因为其在病毒表面上及运种蛋白的抗体可有效中和病毒。因此，H7血凝 素化A)的中和表位的单克隆抗体可W是人主动免疫接种的感兴趣的另一选择，特别是对于 处于流感感染高危中的那些个体，如免疫功能低下（immuno-compromised)的患者或者对主 动免疫应答不佳的老年人。重要的是任何mAb产物均应赋予针对循环中的H7流感毒株的广 泛保护作用。
[0011]期望鉴别可用于预防和治疗H7流感的单克隆抗体。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明设及鼠单克隆抗体(mAb)llB9和mAb 62及其活性片段，其均祀向甲型流感 H7血凝素的主要中和表位。本发明还设及使用鼠 mAb llB9、mAb 62或其片段预防和治疗H7 流感的方法和组合物。本发明进一步设及确定、鉴别和/或定量(a)样品或疫苗中的甲型流 感血凝素或者(b)甲型流感血凝素的抗体的方法和试剂盒。
[0014] 因此，第一方面，本发明提供了特异于流感H5血凝素的主要构象表位的单克隆抗 体及其活性片段即抗原结合片段(在本文也称作抗体片段）。在一个实施方案中，所述单克 隆抗体或其片段特异性结合H7血凝素化A)的构象表位，其中所述构象表位包含H7N7(A/ Netherlands/219/03)蛋白的全长HA蛋白的氨基酸136Ser、137Gly和227G1U，所述全长HA蛋 白包括信号蛋白。全长编码序列示于SEQ ID N0:1，其相应于也包括5'和3'侧翼序列的 〇6诚曰证登录号4￥338459所示序列的核巧酸22-1710。全长蛋白序列示于569 10^:2。在另 一个实施方案中，所述单克隆抗体或其片段特异性结合鼠 mAb 11B9所特异性结合的H7血凝 素的构象表位。在再一个实施方案中，所述单克隆抗体是鼠 mAb 11B9。在进一步的实施方案 中，所述单克隆抗体是由鼠杂交瘤11B9产生的鼠 mAb 11B9。
[0015] 在一个实施方案中，所述单克隆抗体或其片段特异性结合H7血凝素化A)的构象表 位，其中所述构象表位包含全长HA蛋白的氨基酸17化ys和227G1U，所述全长HA蛋白包括信 号蛋白。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体或其片段特异性结合鼠 mAb 62所特异性结 合的H7血凝素的构象表位。在再一个实施方案中，所述单克隆抗体是鼠 mAb 62。在进一步的 实施方案中，所述单克隆抗体是由鼠杂交瘤62产生的鼠 mAb 62。
[0016] 在另一个实施方案中，本发明提供了编码本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段 的核酸。在一个实施方案中，所述核酸编码鼠 mAb 11B9或mAb62或者其抗原结合片段。在再 一个实施方案中，本发明提供了包含所述核酸的载体(vector)。在进一步的实施方案中，本 发明提供了包含和表达所述载体的细胞。
[0017]第二方面，本发明提供了使用鼠单克隆抗体mAb 11B9或mAb 62或其片段预防和治 疗册N1流感的方法和组合物。在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本 文描述的单克隆抗体及药物可接受的稀释剂或运载体barrier)。在一些实施方案中，所述 单克隆抗体是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含本文描述 的单克隆抗体的抗原结合片段及药物可接受的稀释剂或运载体。在一些实施方案中，所述 抗原结合片段是鼠 mAb 11B9或mAb 62的抗原结合片段。在再一个实施方案中，所述药物组 合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子及药物可接受的稀释剂或运载体。在进一步 的实施方案中，所述药物组合物包含具有所述核酸的载体及药物可接受的稀释剂或运载 体。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含表达所述载体的细胞及药物可接受的稀释 剂或运载体。在再一个实施方案中，所述药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸 分子及药物可接受的稀释剂或运载体。在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含具有 所述核酸的载体及药物可接受的稀释剂或运载体。在另一个实施方案中，所述药物组合物 包含表达所述载体的细胞及药物可接受的稀释剂或运载体。
[0018] 在一个实施方案中，本发明提供了一种减少对象中流感H7病毒感染或者降低对象 中流感H7病毒感染风险、抑制对象一或多种流感H7病毒毒株感染或者预防一或多种流感H7 病毒毒株所致流感感染或疾病的方法。在运个实施方案中，所述方法包括给有需要的对象 施用治疗有效量的本文所述单克隆抗体或其抗原结合片段、包含编码所述抗体或抗体片段 的多核巧酸的核酸分子、包含所述多核巧酸的载体或者表达所述载体的细胞。在一些实施 方案中，所述单克隆抗体是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在一个实施方案中，所述对象是免疫功能 低下的，是婴儿、幼儿或者老人。在另一个实施方案中，所述施用提供了治疗益处。在再一个 实施方案中，所述治疗益处包括抑制流感病毒滴度的增加、降低流感病毒滴度、抑制流感病 毒复制的增加、降低流感病毒复制、抑制流感病毒增殖的增加或者降低流感病毒的增殖，或 者降低对象中与流感病毒感染相关的一或多个症状或并发症的进展、严重度、频率、持续时 间或可能性。在一个实施方案中，所述症状或并发症选自发冷、发热、咳嗽、咽喉痛、鼻充血、 窦充血、鼻感染、窦感染、身体疼痛、头痛、疲劳、肺炎、支气管炎、耳感染、耳痛和死亡。在另 一个实施方案中，所述治疗益处包括促进对象从流感H7病毒感染中康复。在进一步的实施 方案中，给对象施用的药剂在对象感染流感H7病毒之前、基本同时或者之后施用。
[0019] 第Ξ方面，本发明提供了使用本文所述单克隆抗体或其片段鉴别、表征和/或定量 H7表达的方法和组合物。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在一 个实施方案中，所述H7表达设及H7流感病毒的HA的表达。在一个实施方案中，所述组合物包 含本文描述的单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠 mAb 11B9或 mAb 62。在另一个实施方案中，所述方法包括检测H7与本文描述的单克隆抗体或其片段的 结合。在一些实施方案中，所述单克隆抗体是鼠 mAbllB9或mAb 62。在一个实施方案中，本发 明设及利用运种结合蛋白的免疫巧光测定（IFA)、免疫组织化学测定及其它方法，包括 ELISA、血凝抑制化I)测定及病毒中和(VN)测定。在一个实施方案中，可W利用本文描述的 双功能化ISA测定。
[0020] 在一些实施方案中，所述鉴别和/或定量H7表达的方法和组合物是用于鉴别和/或 定量疫苗中的H7病毒免疫原性物质。在一个实施方案中，所述免疫原性物质包含血凝素或 其抗原性部分，或者编码血凝素或其抗原性部分的核酸。在另一个实施方案中，所述抗原性 部分包括血凝素的表位。在一个实施方案中，所述免疫原性物质是包含血凝素的病毒。在另 一个实施方案中，所述病毒是灭活的。在再一个实施方案中，所述病毒是减毒的病毒。在另 一个实施方案中，所述病毒是病毒体(virosome)形式。在进一步的实施方案中，所述病毒是 得自鸡蛋或者得自细胞培养。在另一个实施方案中，所述免疫原性物质是包含血凝素的裂 解病毒(split virus)或者裂解病毒抗原性制备物。在一个实施方案中，所述免疫原性物质 是血凝素或其抗原性部分。在另一个实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分已经被分离。 在再一个实施方案中，所述血凝素或其抗原性部分是由表达系统产生的。在一个实施方案 中，所述表达系统是任何表达系统，如病毒表达载体，其中所述血凝素或其抗原性部分呈现 或展示于病毒表面上。在一个实施方案中，所述病毒表达载体是任何表达载体，如修饰的痘 苗病毒表达载体、腺病毒表达载体、痘病毒表达载体、杆状病毒表达载体等。在一个实施方 案中，所述表达载体是杆状病毒表达载体，且呈现或展示血凝素或其抗原性部分的病毒是 杆状病毒。在另一个实施方案中，所述免疫原性物质是编码血凝素或其抗原性部分的核酸， 其能在对象中表达。
[0021] 第四方面，本发明提供了检测生物样品中甲型流感H7亚型病毒或者检测生物样品 中针对甲型流感H7血凝素的抗体(在本文称作抗-H7抗体）的试剂盒和方法。在检测生物样 品中甲型流感H7亚型病毒的一个实施方案中，所述方法包括将样品与第一抗体接触，第一 抗体是如本文所述的单克隆抗体或其抗体片段(有时称作捕获抗体）。在另一个实施方案 中，所述方法进一步包括将样品与如本文所述的特异性结合甲型流感H7亚型病毒的H7血凝 素表位的第二抗体或其抗体片段接触，其中第二抗体含有或者与可检测元件缀合(有时称 作检测抗体）。在检测生物样品中针对甲型流感H7血凝素的抗体的一个实施方案中，所述方 法包括将已经加入甲型流感H7亚型病毒的对照H7血凝素（在本文有时称作对照H7抗原）的 样品与第一抗体接触，第一抗体是如本文所述的单克隆抗体或其抗体片段(有时称作捕获 抗体）。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括将样品与本文所述的特异性结合甲型流 感H7亚型病毒的H7血凝素表位的第二抗体或其抗体片段接触，其中第二抗体含有或者与可 检测元件缀合(有时称作检测抗体）。在一些实施方案中，第二抗体含有放射性原子，与巧光 分子缀合，或者与酶缀合。在其它实施方案中，第一抗体固定在固体表面上。在一些实施方 案中，第一单克隆抗体是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在其它实施方案中，第二单克隆抗体是mAb 11B9或mAb 62。在一个实施方案中，对照H7抗原是重组H7抗原。在另一个实施方案中，对照 H7抗原是表面表达H7的病毒如杆状病毒。在一个实施方案中，本发明设及利用运种单克隆 抗体或相关结合蛋白的免疫巧光测定（IFA)、免疫组织化学测定及其它方法，包括化ISA、血 凝抑制化I)测定和病毒中和(VN)测定。在一个实施方案中，可W利用如本文所述的双功能 ELISA测定。
[0022] 在一个实施方案中，测定是双功能化ISA，其对于H7禽流感病毒的抗原和抗体检测 均有效。在一个实施方案中，mAb 11B9或mAb 62之一用作捕获抗体，mAb 11B9或mAb 62的另 一种用作检测抗体。在一个实施方案中，捕获抗体包被在固相如微滴定板、微珠等上。为了 检测生物样品中的抗原，将样品与捕获抗体接触足W使得样品中的任何H7抗原与捕获抗体 结合的一段时间。然后将检测抗体与结合的样品H7抗原(如果有的话)接触足W使得检测抗 体与所述结合的样品H7抗原结合的一段时间。然后确定任何检测抗体的结合，W确定样品 中H7抗原的存在和/或量。为了检测生物样品中的抗-H7抗体，将对照H7抗原加入生物样品 中W制备混合物。在一个实施方案中，将固定量的对照H7抗原加入生物样品中。对照H7抗原 结合生物样品中也许存在的任何抗-H7抗体。然后将混合物与捕获抗体接触足W使得对照 H7抗原结合捕获抗体的一段时间。如果抗-H7抗体存在于生物样品中，与捕获抗体结合的对 照H7抗原中的一些将结合抗-H7抗体，且与捕获抗体结合的对照H7抗原中的一些将游离于 结合的抗体。在一个实施方案中，对照H7抗原是重组H7抗原。在另一个实施方案中，对照H7 抗原是表面表达H7的病毒如杆状病毒。然后将检测抗体与不与样品H7抗体(如果有的话)结 合的任何结合的对照H7抗原接触一段时间，所述时间足W使得检测抗体结合不与样品H7抗 体结合的结合的对照H7抗原。然后确定检测抗体的结合，W确定样品中H7抗体的存在和/或 量。在一个实施方案中，结合的检测抗体的水平降低表示生物样品中存在抗-H7抗体。
[0023] 在一个实施方案中，所述试剂盒包含第一抗体及进行检测甲型流感H7亚型病毒的 测定的说明书，所述第一抗体是本文描述的单克隆抗体或其抗体片段。在一些实施方案中， 所述单克隆抗体是鼠 mAb 11B9或mAb 62。在另一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含特 异性结合甲型流感病毒的H7血凝素表位的第二抗体，其中第二抗体含有或者与可检测元件 缀合。在一些实施方案中，第二抗体是mAb 11B9或mAb 62。在一些实施方案中，第二抗体含 有放射性原子，与巧光分子缀合，或者与酶缀合。在其它实施方案中，第一抗体固定在固体 表面上。在另一个实施方案中，试剂盒进一步包含H7血凝素抗原。在一些实施方案中，H7血 凝素抗原是重组H7蛋白。在其它实施方案中，H7血凝素抗原是表面表达H7的病毒如杆状病 毒。在一个实施方案中，试剂盒可用于鉴别和/或定量疫苗中的H7病毒免疫原性物质。在另 一个实施方案中，试剂盒可用于检测生物样品中H7血凝素或者针对H7血凝素的抗体。在一 个实施方案中，本发明设及利用运种单克隆抗体或相关结合蛋白的免疫巧光测定(IFA)、免 疫组织化学测定及其它方法，包括化ISA、血凝抑制化I)测定和病毒中和(VN)测定。在一些 实施方案中，可利用本文所述双功能化ISA测定。
[0024] 附图简述
[0025] 图1A和1B示出mAb 11B9和62在小鼠中对抗H7N7的预防作用。图1A:结果W存活百 分比表示。PBS用作阴性对照。图1B:结果W体重百分比（在实验开始时)表示。PBS用作阴性 对照。
[0026] 图2A-2D示出在小鼠中mAb 62对抗H7攻击的预防作用。图2A和2B:小鼠组(η = 5)经 鼻内给予2.5mg/kg、5mg/kg、lOmg/kg或者0mg/kg(PBS)的mAb 62进行预处理。图2C和2D:小 鼠组(n = 5)在经5MLD日日的小鼠适应的HPAI H7N7(A/Netherlands/219/03，RG)攻击前一天经 腹膜内用5mg/kg、10mg/kg或0mg/kg(PBS)的mAb 62预处理。监测小鼠在14天观测期的存活 及体重丧失情况。结果分别W存活百分比（图2C和2D)和体重百分比（图2A和2B)(在实验开 始时)表示。
[0027] 图3A和3B示出mAb 62在小鼠中针对H7攻击的治疗效力。小鼠组(η = 5)感染5MLD50 的小鼠适应的ΗΡΑΙ H7N7(A/Netherlands/219/03，RG)。在攻击后一天，将小鼠通过腹膜内 途径用15mg/kg的mAb 62或者通过鼻内途径用5mg/kg、1 Omg/kg、15mg/kg或Omg/kg (PBS)的 mAb 62处理。监测在14天观测期小鼠的存活和体重丧失情况。结果分别W存活百分比（图 3B)和体重百分比（图3A)(在实验开始时)表示。
[0028] 图4A和4B示出在小鼠中两剂mAb 62针对H7攻击的治疗效力。小鼠组(η = 5)感染 10MLD50的小鼠适应的ΗΡΑΙ H7N7(A/Netherlands/219/03，RG)。在攻击后 1 天、2天或7天，将 小鼠通过鼻内途径用lOmg/kg或Omg/kg(PBS)的mAb 62处理一或两次。监测14天观测期小鼠 的存活及体重丧失情况。结果分别W存活百分比（图4B)和体重百分比（图4A)(在实验开始 时)表示。Dpi:感染后天数。
[0029] 图5A-祀示出在被动处理的小鼠中肺组织的组织病理学。在用5MLD50的HPAI H7N7 (A/Netherlands/219/03，RG)实验性病毒感染后通过鼻内或腹膜内途径用mAb 62(15mg/ kg)处理的小鼠的皿染色的肺切片的显微照片。图5A:在感染后14天收集的经鼻内途径用 mAb 62处理的小鼠的肺切片。图5B:在感染后14天收集的经腹膜内途径用mAb 62处理的小 鼠的肺切片。图5C:在感染后6天收集的未处理的感染小鼠的肺切片。图5D:在感染后8天收 集的未处理的感染小鼠的肺切片。图5E:未感染的小鼠的肺切片。
[0030] 图6示出在被动处理的小鼠肺中病毒感染性滴度的测量。小鼠在用5MLD50的HPAI H7N7(A/Netherlands/219/03，RG)实验性病毒感染之后用mAb 62(15mg/kg)通过鼻内或腹 膜内途径处理。在感染后2、4、6和14天收集肺样品。肺中荷载的病毒结果Wlogio