TCI化o/g平 均数表示/'r表示组中无任何动物存活。（*，？<0.05;**，？<0.01;林*，？<0.001;11 = 5;与腹 膜内途径对应组相比鼻内途径组的点）。
[0031 ]图7示出在双功能化ISA中抗原和抗体检测程序。
[0032] 图8示出在双功能化ISA中H7抗原检测的特异性。在双功能-ELISA中H7抗原检测的 特异性使用10化1含有H7毒株的PBS(调节为HA滴度为8或者非H7病毒的HA滴度含16)检验。 数值表示来自两个独立检验的一式两份孔的吸光度平均数。0D 490:在490nm的光密度;虚 线:截断值(州t-off) ;Blank AF:无病毒的尿囊液。
[0033] 图9示出在双功能化ISA中H7抗原检测的灵敏度。将HA滴度为16的测试病毒双倍稀 释，并进行双功能化ISA检测抗原。数值表示两个独立检验的一式两份孔的吸光度平均值。 0D 490:在490nm的光密度;虚线:截断值。
[0034] 图10示出在双功能化ISA中H7抗体检测的特异性。在第二次免疫后10天收集来自 用不同流感病毒亚型免疫的不同动物的血清，并标准化至16的HI滴度，之后在双功能化ISA 中检测。截断值为30%封闭W上的抑制被认为是阳性；即存在H7的抗体。结果W封闭值百分 比的算术平均值表示。址7N7:海道/1/10;化:鸡;Gp:豚鼠；Ms:小鼠；Bac:野生型杆 状病毒免疫的血清;空白：免疫前血清。虚线:截断值。
[0035] 发明详述
[0036] 本发明设及鼠单克隆抗体(mAb)llB9和mAb 62及其活性片段，其祀向甲型流感H7 血凝素的主要中和表位。本发明还设及使用鼠 mAb llB9、mAb 62或其片段预防和治疗H7流 感的方法和组合物。本发明进一步设及确定、鉴别和/或定量(a)样品或疫苗中甲型流感血 凝素或者(b)甲型流感血凝素的抗体的方法和试剂盒。
[0037] "分离的"是指不含其天然伴随的至少一些组分的生物分子。
[0038] 如本文所用，术语"抗体"是本领域公认的术语，是指结合已知抗原的分子或分子 的活性片段，特别是免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结 合抗原的结合位点的分子。免疫球蛋白是包含基本上由免疫球蛋白K和λ、α、丫、δ、ε和μ恒定 区基因 W及众多免疫球蛋白可变区基因编码的一或多个多肤的蛋白。轻链分类为Κ或λ。重 链分类为丫、μ、日、δ或e，其进而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、I曲和IgE。重链的亚 类也已知。例如，人中IgG重链可W是任何IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚类。本发明的免疫球蛋 白可W是任何类别（1旨6、1旨1、1曲、1姐、1旨4和1旨￥)或亚类（1旨61、1旨62、1旨63、1旨64、1旨41和 IgA2)的免疫球蛋白分子。
[0039] 如本文所用，关于抗体的"特异性结合"是指抗体结合其祀抗原的亲和力高于其与 结构不同的抗原的结合亲和力。
[0040] 已知典型的免疫球蛋白结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肤链组 成，每对具有一"轻锥'（大约2化D)和一"重锥'（大约50-70kD)。每条链的N末端定义一个大 约100-110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(Vl)和可变重链 (Vh)分别是指运些轻链和重链。
[0041] 抗体W全长完整的抗体或者W许多充分鉴定的通过各种肤酶或化合物消化而产 生的片段而存在。因此，例如，胃蛋白酶消化抗体较链区中二硫键产生F(ab'）2,运是化b二 聚体，Fab本身是轻链通过二硫键与Vh-CHi结合。F(ab'）2在适当条件下可W还原W破坏较链 区中的二硫键，从而将F(ab '）2二聚体转变为化b '单体。Fab '单体基本上是具有较链区部分 的化13片段（见F^mdamen^l Immunology ,W.E.Paul ,ed. ,Raven Press,N.Y. (1993)关于其 它抗体片段的更详细的描述）。虽然各种抗体片段是根据完整抗体的消化而定义，但是技术 人员意识到任何各种抗体片段可W通过化学或利用重组DNA方法重新合成。因此，如本文所 用，术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的或者重新合成的抗体片段或者通过使用重组 DNA方法获得的抗体和片段。
[0042] 在本发明范围内的"抗体"包括嵌合的或人源化的单克隆抗体，W及其活性片段。 结合已知抗原的分子的活性片段例如包括分开的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、化b'和F (ab'）2片段，包括化b免疫球蛋白表达文库的产物及上述任何抗体和片段的表位结合片段。
[0043] 运些活性片段可W通过许多技术而衍生自本发明的抗体。例如，单克隆抗体可W 用酶如胃蛋白酶裂解，并进行HPLC凝胶过滤。然后收集含有化b片段的合适级分，并通过膜 过滤等浓缩。关于分离抗体的活性片段的一般技术的进一步描述见例如Khaw et al. (1982);Rousseaux et al.(1986)。
[0044] 重组产生的抗体可W是常规的全长抗体、已知来自蛋白酶消化的活性抗体片段、 独特的活性抗体片段如Fv或单链Fv(scFv)、结构域缺失的抗体等。Fv抗体大小为大约50Kd， 包含轻链和重链的可变区。单链Fv(scFv)多肤是共价连接的VH::化异源二聚体，其可W表 达自包括直接连接或通过肤编码接头连接的VH和化编码序列的核酸。见化ston et al. (1988)。将来自抗体V区的天然聚集的但是化学上分开的轻多肤链和重多肤链转变为scFv 分子的许多结构折叠为与抗原结合位点的结构基本相似的Ξ维结构。见例如美国专利号5， 091，513;5,132,405和4,956,778。
[0045] 组合位点レombining site)是指参与抗原结合的抗体分子的部分。抗原结合位点 是由重链化)和轻链化)的N末端可变(V)区的氨基酸残基形成的。抗体可变区包含Ξ个非常 不同的序列，称作"高变区"或者巧补决定区（CDR)"，其插入在称作"框架区(FR)"的更保守 的两侧序列之间。在抗体分子中，轻链的Ξ个高变区化CDRULCDR2和LCDR3)和重链的Ξ个 高变区化CDR1、HCDR2和HCDR3)在Ξ维空间彼此相对地形成抗原结合表面或口袋。因此抗体 组合位点代表组成抗体的CDR的氨基酸及组成结合位点口袋的任何框架残基。
[0046] 特定抗体中的组成组合位点的氨基酸残基的身份可W使用本领域熟知的方法确 定。见例如美国专利申请公开No. 2010/0080800。特定抗体中在CDR外部但是通过具有是组 合位点边界（lining)-部分的侧链（即其可用于连接组合位点）而组成组合位点一部分的 氨基酸残基的身份，可W使用本领域熟知的方法确定，如分子建模和X-射线晶体学方法。见 例如Riechmann et 日1.(1988)。
[0047] 嵌合抗体是其中抗体的一或多个区来自一种动物且所述抗体一或多个区来自不 同种动物的那些抗体。优选的嵌合抗体是包含来自灵长类动物免疫球蛋白区域的抗体。人 临床应用的嵌合抗体一般理解为具有来自非人动物如晒齿动物的可变区及来自人的恒定 区。相反，人源化抗体使用来自非人抗体的CDR，及大多数或所有可变框架区来自人免疫球 蛋白及所有恒定区来自人免疫球蛋白。人嵌合抗体一般理解为具有晒齿动物可变区。典型 的人嵌合抗体具有人重链恒定区和人轻链恒定区，重链和轻链的可变区均来自晒齿动物抗 体。嵌合抗体可在人恒定区的天然氨基酸序列和天然晒齿动物可变区序列包含一些改变。 嵌合的和人源化抗体可W通过本领域熟知的方法制备，包括CDR移植方法(见例如美国专利 齡.5,843,708、6，180,370、5,693,762、5,585,089、5,530，101)、链改组策略（见例如美国专 利No. 5，565，332; Rader et al. (1998))、分子建模策略(美国专利No. 5，639，641)等。
[0048] 如本文所用，"人源化抗体"在两条链的抗体的情况中，至少一条链是人源化的。人 源化抗体链具有可变区，其中一或多个框架区是人框架区。单链的人源化抗体是其中所述 链具有可变区，其中一或多个框架区是人框架区。人源化抗体链或其片段的可变区的非人 部分衍生自非人来源，特别是非人抗体，典型是晒齿动物来源。人源化抗体的非人部分一般 W至少一个CDR区的形式提供，其散布于衍生自一(或多)个人免疫球蛋白的框架区之中。此 夕h框架支持残基可W被改变W保留结合亲和力。
[0049] 人源化抗体可进一步包含恒定区（例如在轻链情况中至少一个恒定区或其一部 分，及优选在重链情况中Ξ个恒定区）。人源化抗体的恒定区如果存在通常是人恒定区。获 得"人源化抗体"的方法为本领域技术人员熟知。见例如美国专利申请公开No. 2010/ 0080800。
[0050] 如本文所用，术语恒定区（CR)是指免疫球蛋白的恒定区基因。恒定区基因编码赋 予效应子功能的抗体分子部分。对于嵌合的人抗体和人源化抗体，典型地非人(例如鼠）恒 定区由人恒定区取代。所述嵌合或人源化抗体的恒定区典型衍生自人免疫球蛋白。重链恒 定区可选自任何五个同种型:日、S、e、丫或μ。进一步地，各个亚类的重链(如重链IgG亚类)与 不同的效应子功能相关，因此通过选择希望的重链恒定区，可W产生具有希望的效应子功 能的抗体。在本发明范围内可W使用的恒定区是丫 l(IgGl)，特别是丫 l(IgGl)同种型的化 区，丫 3(IgG3)及特别是丫 4(IgG4)。轻链恒定区可W是K或λ类型，优选K类型。在一个实施方 案中，轻链恒定区是人Κ恒定区化ieter et al.(1980))，重链恒定区是人IgG4恒定区。
[0051] 如本文所用，术语可变区（VR)是指抗体中每对轻链和重链内的结构域，其直接参 与抗体与抗原的结合。每个重链在一个末端具有一个可变结构域(Vh)，随后是许多恒定结 构域。每个轻链在一个末端具有一个可变结构域(Vl)及在另一末端的一个恒定结构域;轻 链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对其，且轻链可变结构域与重链的可变结构域 对齐。
[0052] 如本文所用，术语框架区(FR)是指抗体的轻链和重链的可变区内的一或多个框架 区（见Kabat et al.(1992);Johnson and Wu(2001);http colon backslash backslash immuno dot bme dot nwa dot edu)。运些表述包括插入在抗体轻链和重链的可变区内CDR 之间的那些氨基酸序列。
[0化3] CDR和FR残基根据标准序列定义化abat et al.(1991)和结构定义（例如化othia and Lesk(1987))确定。在运两种方法导致略微不同的CDR鉴别的情况中，优选结构定义，但 是通过序列定义方法鉴别的残基被认为是重要的FR残基W确定哪个构架残基进入共有序 列中。
[0054] 术语"单克隆抗体"在本领域也充分认可，是指单克隆的抗体生产细胞的产物。单 克隆抗体典型是通过融合正常短存活的抗体生产B细胞与快速生长细胞如癌细胞(有时称 作"永生细胞"）而产生的。所得的杂交细胞或者杂交瘤快速倍增，获得产生抗体的克隆。
[0055] 术语"片段"是指抗体或抗体链的一部分，其包含比完整的或完全的抗体或抗体链 较少的氨基酸残基。片段可W通过化学或酶处理完整或完全抗体或抗体链而获得。片段也 可W通过重组方式获得。举例的片段包括化6、化6'^(313'）2^36(3和/或。巾片段。术语"抗原 结合片段"是指免疫球蛋白或抗体的结合抗原或与完整抗体(及与其衍生自之中的完整抗 体)竞争结合抗原（即特异性结合）的多肤片段。结合片段是通过重组DNA技术产生的，或者 通过酶或化学裂解完整免疫球蛋白产生的。结合片段包括化6、化6'、。(曰13'）2、、化6(3、。乂、单 链和单链抗体。
[0056] 具有降低的免疫原性的人源化抗体是指运样的人源化抗体，其呈现出相对于亲代 抗体如鼠抗体降低的免疫原性。
[0057] 基本上保留亲代结合性质的人源化抗体是指运样的人源化抗体，其保留特异性结 合由用于产生运种人源化抗体的亲代抗体所识别的抗原的能力。优选地，人源化抗体呈现 出与亲代抗体相同或基本相同的抗原结合亲和力和亲合力。理想地，抗体的亲和力不低于 亲代抗体亲和力的10%，，更优选不低于大约30%，最优选所述亲和力不低于亲代抗体的 50 %。测定抗原结合亲和力的方法为本领域熟知，包括半最大结合测定、竞争测定和 Scatchard 分析。
[0058] 进一步地，术语"治疗有效量"是指当给人或动物施用时足W在所述人或动物中获 得治疗作用的抗体的量。有效量易于由本领域技术人员根据常规方法确定。
[0059] 如本文所用，术语"治疗"、"预防"是指在对象中由于施用预防性或治疗性药剂而 获得的预防疾病的一或多个症状复发或发生。
[0060] 第一方面，本发明提供了特异于流感H7血凝素的主要中和表位的单克隆抗体及其 活性片段即抗原结合片段(在本文也称作抗体片段）。在一个实施方案中，所述单克隆抗体 或其片段特异性结合H7血凝素化A)的构象表位，其中所述构象表位包含全长HA蛋白的氨基 酸136Ser、137Gly和227G1U，所述全长HA蛋白包括信号蛋白。编码包含信号蛋白的HA蛋白的 核巧酸序列在SEQ ID NO: 1示出，包含信号蛋白的HA蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO: 2示 出。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体或其片段特异性结合鼠 mAb 11B9所特异性结合 的H7血凝素的构象表位。在再一个实施方案中，所述单克隆抗体是鼠 mAb 11B9。在进一步的 实施方案中，所述单克隆抗体是由鼠杂交瘤11B9产生的鼠 mAb 11B9。鼠杂交瘤11B9于2012 年9月ll日根据布达佩斯条约保藏在CellBankAus1:ralia,2l4化wkesbu;ryRd,Westmead NSW 2145,4113付日11日，指派保藏号为〔8420120022。本发明还设及产生鼠单克隆抗体1189的 鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体是嵌合或人源化单克隆抗体。特别地，所 述嵌合或人源化单克隆抗体特异性结合鼠单克隆抗体11B9所特异性结合的H5血凝素的构 象表位。在一个实施方案中，所述单克隆抗体（鼠单克隆抗体或嵌合或人源化单克隆抗体） 或其片段特异性结合H7血凝素化A)的构象表位，其中所述构象表位包含全长HA蛋白的氨基 酸136Ser、137Gly和227G1U，所述全长HA蛋白包括信号蛋白。
[0061] 在一个实施方案中，所述单克隆抗体或其片段特异性结合H7血凝素化A)的构象表 位，其中构象表位包含全长HA蛋白的氨基酸17化ys和227G1U，所述全长HA蛋白包含信号蛋 白。编码包含信号蛋白的HA蛋白的核巧酸序列在SEQ ID NO: 1示出，包含信号蛋白的HA蛋白 的氨基酸序列在SEQ ID NO: 2示出。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体或其片段特异性 结合鼠 mAb 62所特异性结合的H7血凝素的构象表位。在再一个实施方案中，所述单克隆抗 体是鼠 mAb 62。在进一步的实施方案中，所述单克隆抗体是由鼠杂交瘤62产生的鼠 mAb 62。 鼠杂交瘤62于2012年9月11日根据布达佩斯条约保藏在CellBank Australia, 214Hawkesbury Rd,Westmead NSW 2145,Australia,指派保藏号为CBA20120023。本发明还 设及产生鼠单克隆抗体62的鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体是嵌合或人 源化单克隆抗体。特别地，所述嵌合或人源化单克隆抗体特异性结合鼠单克隆抗体62所特 异性结合的H5血凝素的构象表位。在一个实施方案中，所述单克隆抗体（鼠单克隆抗体或嵌 合的或人源化单克隆抗体)或其片段特异性结合H7血凝素化A)的构象表位，其中构象表位 包含全长HA蛋白的氨基酸175Lys和227G1U，所述全长HA蛋白包含信号蛋白。
[0062] 在另一个实施方案中，本发明提供了编码鼠 mAb 11B9或mAb 62或者本文所述嵌合 的或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸。在再一个实施方案中，本发明提供了包 含所述核酸的载体。在进一步的实施方案中，本发明提供了包含和表达所述载体的细胞。
[0063] 在一个实施方案中，人源化抗体是通过使用本文所述技术W及本领域技术人员熟 知的技术组合人重链和轻链恒定区与小鼠重链和轻链可变区而制备的。在另一个实施方案 中，制备人源化抗体，其中DNA序列是合成的，其编码含有鼠 mAb 11B9或mAb 62的小鼠轻链 和重链可变区的CDR人源化化和Vh序列。
[0064] 合成编码已知序列的蛋白的DNA的方法为本领域熟知。使用运种方法，合成编码本 发明人源化抗体的DNA序列，然后在适于重组抗体表达的载体系统中表达。运可W在提供本 发明人源化抗体序列的任何载体系统中实现，如包含人恒定区序列及与产生功能性(抗原 结合)抗体相关的小鼠可变结构域序列的融合蛋白的表达。
[0065] 表达载体、适于表达重组抗体和人源化抗体的宿主细胞及适于表达运种抗体的方 法为本领域熟知。见例如美国专利No. 7，074，406。
[0066] 已知能表达功能性免疫球蛋白的宿主细胞包括例如哺乳动物细胞如中国仓鼠卵 巢(C册)细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、细菌如大肠杆菌、酵母细胞如酿酒酵母等宿主细胞。在 运些细胞中，鉴于C册细胞的有效表达和分泌免疫球蛋白的能力而由许多研究者使用。
[0067] 本质上，人源化抗体的重组表达是通过两种一般方法之一实现的。在第一方法中， 将宿主细胞用单一载体转染，所述载体提供与选择的恒定区融合的重链和轻链可变序列的 表达。在第二方法中，宿主细胞用两种载体转染，其分别提供与选择的恒定区融合的可变重 链或轻链序列的表达。
[0068] 第二方面，本发明提供了预防和治疗H7流感的方法和组合物，使用本发明所述单 克隆抗体或抗体片段如鼠 mAb 11B9或mAb 62或者嵌合的或人源化单克隆抗体或其片段进 行。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明所述鼠 mAb 11B9或mAb 62或者嵌合的或 人源化单克隆抗体及药物可接受的稀释剂或运载体的药物组合物。在另一个实施方案中， 所述药物组合物包含本发明所述单克隆抗体的抗原结合片段及药物可接受的稀释剂或运 载体。在一个实施方案中，所述抗原结合片段是mAb 11B9或mAb 62的抗原结合片段。在再一 个实施方案中，所述药物组合物包含编码所述抗体或抗体片段的核酸分子及药物可接受的 稀释剂或运载体。在进一步的实施方案中，所述药物组合物包含具有所述核酸的载体及药 物可接受的稀释剂或运载体。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含表达所述载体的 细胞及药物可接受的稀释剂或运载体。
[0069] 在一个实施方案中，本发明提供了降低对象中H5N1流感病毒感染、或者降低对象 中H7流感病毒感染风险、抑制对象感染一或多种H7流感病毒