uts&Bolts of siRNA Technology ,DNA Press ,2003；Gott,RNA Interference,Editing, and Modification : Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Human Press，Totowa，NJ，2004;Sohail，Gene Silencing by 民NA Interference:Technology and Application,C民C，2004d 实施例
[0086] 本发明通过如下实施例描述，所述实施例只是例证本发明，不^任何方式限制本 发明。利用本领域熟知的标准技术或者下文特别描述的技术。
[0087] 实施例1
[0088] 材料和方法
[00例病毒和细胞:这项研究中使用的H7Nl(A/chicken/Malaysia/94)及其它AIV得自新 加坡Agri-Food&VeterinaryAu化orityD重配株流感病毒H7N9(A/Shanghai/l/13)、H7N3 (A/Canada/rv504/04)、H7N6(A/quail/Aichi/3/09)，H7N7(A/duck/Hokkaido/l/10)和H7N7 (A/Netherlands/219/03)通过先前所述的反向遗传学产生化0 et al. ,2009)。简而言之， 基于NCBI流感病毒数据库的序列合成H7病毒的HA和NA基因的互补DNA，内部基因的六个 cDNA基于PR8(A/Puerto Rico/8/1934)病毒序列（GenScript，USA)合成。将8个流感病毒基 因节段每一个的cDNA插入pClpolsaplT载体的pol I启动子(P化）与pol I终止子之间（由 Ruben Donis，CDC，USA善意提供），并共转染进共培养的293T人胚胎肾（293T)细胞和Madin- Darby犬肾（MDCK)细胞中，使用lipofectamine 2000(Xife Technologies，USA)进行D在48 小时后，收集转染的上清并通过标准血凝测定确定。使用如先前所述(Prabakaran et al.， 2009)-特定系列的通用引物证实序列。将原种病毒(stock virus)在11天龄含胚鸡卵的尿 囊腔中在35°C增殖36小时-91小时。然后通过Muench-Reed方法（1938)计算重配株病毒的组 织培养感染剂量50(TCID50)。
[0090] MDCK细胞得自美国典型培养物保藏中屯、(ATCC)。将MDCK细胞在补加10%胎牛血清 的Didbecco's最小基本培养基(DMEM;Life Technologies,USA)中增殖。将病毒原种在补加 0.5%牛血清白蛋白（BSA)和200ng/ml膜蛋白酶的DMEM中在MDCK细胞中生长。将293T细胞在 含有5%FBS的Opti-MEMI(Life Technologies,USA)中维持。
[0091] 使用高致病性病毒的所有实验均遵从CDC/NIH和W册的建议在生物安全水平3(BSL 3)防护设备中进行且也获得新加坡Agri-Food and Veterinary Authority许可。
[0092] MAb产生:将BALB/c小鼠 W2周的规律间隔用在0.1ml憐酸盐缓冲盐水(PBS)中的来 自H7Nl(A/cMcken/Malaysia/94)的二乙締亚胺(BEI)灭活的完整病毒在皮下注射免疫两 次，其用等体积的Montanide ISA 563佐剂（SEPPIC，化ance)乳化。在脾细胞与SP2/0细胞 化e et al. ,2009)融合之前3天，将小鼠用相同的病毒抗原加强(boosted)。将融合的细胞 接种在96孔平板中，其上清通过如下述免疫巧光测定筛选。产生mAb的杂交瘤通过至少3次 有限稀释进行克隆。如下文所述检测阳性mAb的血凝抑制活性。将来自选择的阳性mAb的免 疫球蛋白使用商业分型试剂盒(Amersham Bioscience，England)根据厂商指导分型。在接 种后3天收获杂交瘤上清，细胞碎片通过在400g离屯、10分钟沉淀，随后收集上清并在-20°C 胆存。将mAb用Montage kit ?1'〇369-6(1;[11190'6)针对1旨6纯化或者使用蛋白4琼脂糖珠 (Mi 11 ipore)纯化。抗体的纯度通过SDS-PAGE分析证实。然后通过如下文所述的标准血凝抑 审ij测定检测mAb的中和活性。
[0093] 免疫巧光测定（IFA):将在96孔平板中培养的MDCK细胞用不同的AIV H7毒株感染。 在感染后24小时，将细胞用4%多聚甲醒在室溫固定30分钟，及用憐酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涂2次。将固定的细胞与杂交瘤培养上清在37°C保溫1小时，用憐酸盐缓冲盐水(PBS) 漂洗，然后与1:400或1:200稀释的异硫氯酸巧光素(FITC)-缀合的兔抗小鼠免疫球蛋白 (Dako，Denmark)保溫。将细胞在PBS中再次漂洗，通过宽场epi-巧光显微镜(Olympus 1X71) 评估抗体结合情况。
[0094] 血凝抑制测定：血凝抑制（HI)测定如先前所述（（Prabhu et al . , 2009 ; Prabakaran et al. ,2010)进行。简而言之，将mAb在V形底的96孔平板中系列稀释(2倍），并 与4HA单位的H7病毒混合。将平板在室溫保溫30分钟，在每个孔中加入1 %鸡RBC。血凝抑制 终点是未观测到凝集的最高mAb稀释。
[0095] 微量中和测定:H7毒株的单克隆抗体的中和活性通过先前所述的微量中和测定分 析化e and Kwang,2013)。简而言之，将10倍稀释的mAb进一步系列稀释(2倍），并与10050% 组织培养感染剂量(TCID50)的不同H7毒株进化枝在室溫保溫1小时，并一式两份铺板于在 96孔平板中生长的MDCK细胞上。或者，将mAbW2倍系列稀释，与100TCID50的不同H7毒株进 化枝在室溫保溫1小时，并一式两份铺板于96孔平板中生长的MDCK细胞上。MDCK细胞培养中 每个H7毒株的TCID50通过Reed and Muench(1938)方法确定。中和滴度评价为通过光学显 微镜观测到无细胞病理效应的最高mAb稀释度。
[0096] 逃逸突变体的分离和分析：由mAb 11B9和mAb 62识别的表位如先前所述通过鉴定 逃逸突变体而作图化e et al.，2010;Kaverin et日1.，2007)。简而言之，将H7亲代病毒与 过量的mAb保溫1小时，然后接种于11天龄的含胚鸡卵中。将鸡卵在37°C保溫48-72小时。收 获病毒并用于在含胚鸡卵中有限稀释克隆，并经隧斑纯化逃逸突变体。从尿囊液中提取 RNA。将血凝素化A)基因经逆转录酶(RT)-PCR扩增并克隆进TA克隆载体(Promega)中，对一 些克隆进行测序。通过与亲代病毒的序列对比分析各个克隆的序列。
[0097] 攻击研究(实施例4):4-6周龄的近交系SPF BALB/c小鼠用于攻击研究。小鼠 （n = 10只/组)经鼻内感染5MLD50(50%小鼠致死剂量）的适应的H7N7毒株(A/Netherlands/219/ 03)。所有动物实验均根据Guides for Animal Experiments Performed at NIID和实验方 案进行。
[0098] 预防效力（实施例4):为了确定预防效力，将小鼠用lOmg/kg或0mg/kg(PBS)的mAb 11B9或mAb 62经腹膜内注射在病毒攻击之前预处理。24小时后，将小鼠用5MLD50的H7N7毒 株攻击。每天观测小鼠 W监测体重和死亡率直至所有动物死亡或者直至攻击后14天。
[0099] 免疫和攻击(实施例6-10):对于攻击实验，如先前所述(Brown, 1990)将H7N7重配 株病毒通过Ξ次连续的肺至肺传递W适应小鼠。将在肺传递中存在的病毒在10天龄鸡卵的 尿囊腔中在37°C增殖48小时W制备病毒原种。如Reed和Munch方法所述计算50 %小鼠致死 剂量(MLD50)。4-6周龄的SPF雌性BALB/c小鼠用于攻击研究。小鼠 （η = 5只/组)经鼻内接种5 或10MLD50 (50 %小鼠致死剂量)的致病性Η7Ν7 (A/Nether lands/219/03)毒株。
[0100] 对于鼻内免疫，首先将小鼠经腹膜内用10化1氯胺酬（lOmg/ml)和甲苯嚷嗦（Img/ ml)盐水麻醉。每只小鼠用经鼻内接种10化1的于PBS中的Mab或病毒。
[0101] 预防效力（实施例6-10):为了确定预防效力，小鼠经鼻内或腹膜内用2.5mg/kg、 5mg/kg或lOmg/kg纯化的Mab 62在进行病毒攻击之前预处理。对照小鼠经鼻内仅用PBS处 理。24小时后，将小鼠用5MLD50的H7N7毒株攻击。每天观测小鼠 W监测体重和死亡率直至死 亡或攻击后14天。
[0102] 治疗效力（实施例6-10):为了确定治疗效力，将每组小鼠实验性感染5MLD50的 H7N7毒株。在病毒感染后1天、2天或7天，将小鼠经鼻内或腹膜内途径用5mg/kg、10mg/kg或 15mg/kg的Mab 62处理。感染的对照小鼠经鼻内仅用PBS处理。每天观测小鼠 W监测体重和 死亡率直至死亡或者攻击后14天。
[0103] 组织病理学分析(实施例6-10):在攻击后第2天、第4天和第6天从每组小鼠（N=3) 收获进行组织学检验的肺样品，并固定于10%缓冲的福尔马林(pH 7.4)中，在石蜡中包埋 并切成4μηι切片。将切片使用化31：-油〇;!^6(41]16'3(3〇)脱蜡，在连续梯度乙醇浴中再水合。玻 片用皿染色，通过光学显微镜(Olympus, UK)进行病理学评估。通过数字成像系统捕获图像 (Wkon，USA)。
[0104] 统计学分析(实施例6-10):数据W算术平均数和标准差（SD)表示。进行未配对双 尾Student'S t检验W确定两组平均值之间差异的显著水平。单向方差分析(AN0VA)也用于 检测组间差异。所有统计学分析均用SigmaStat 2.0(Jandel Co巧oration)软件进行。 [0105] 实验性血清样品（实施例ll-15):灭活的AI病毒(表l)在ISA-70(SEPPIC，France) 佐剂中乳化并肌肉注射至3周龄白色来亨鸡(n = 4)中。W2周间隔施用两次加强。从在第一 次和第二次注射后10天收集的血液中制备血清。应答同源株系的抗体通过下述HI评估。小 鼠组(n = 4)肌肉注射在佐剂(SEPPIC，化ance)中单独乳化的不同的灭活的H7AIVdW两周间 隔重复注射两次。此外，用灭活的H7N1(A/化icken/Malaysia/94)免疫豚鼠。在第二次免疫 后14天收集血液。
[0106] H7杆状病毒产生(实施例11-15):如先前所述产生重组杆状病毒载体(Prabakaran et al. ,2010)。在标准PCR反应中从H7N7(A/化/219/03)重配病毒中扩增全长HA基因。将扩 增的齡基因插入穿梭载体口。45了8曰地了4(1醇;[付0邑6]1,5曰]1〇16邑〇,〔4,1]54)中^在白斑综合 征病毒(WSSV)立即早期（iel)启动子下表达。将运个表达盒通过位点特异性转位整合进 DH10BacTM(Invit;rogen,USA)内的杆状病毒基因组中，根据Bac-to-Bac系统（Invitrogen) 的方案进行。将SF9H细胞在28°C在SF90〇n无血清培养基(G化CO BRL，USA)中维持W合成 重组杆状病毒。然后将重组杆粒转染进SF9II细胞中，在感染后96小时收获含有重组杆状病 毒展示的H7-HA(Bac-H7)的上清。
[0107] 双功能化ISA(实施例11-15):将96孔圆底微滴定板(Nunc，Roskilde，Demark)用在 100μΙ碳酸盐缓冲液(73mM碳酸氨钢和30mM碳酸钢，pH 9.7)中的0.扣g/孔的捕获mAb 11B9 在4°C包被过夜或者在37°C包被2小时。将平板用PBST洗涂两次，随后在每次与抗体或抗原 保溫后用PBS洗涂两次。抗体包被的平板通过与10化1封闭缓冲液(含有5%牛奶的PBS)在室 溫保溫1小时而封闭。对于抗原检测，然后将经封闭的平板与在PBST中稀释的10化1含有病 毒的样品在37°C保溫1小时。对于抗体检测，将与50μ1的8HAU表面表达H7的杆状病毒混合的 50μ1血清加入经封闭的平板中，在37°C保溫1小时。病毒结合或抗体封闭通过与10化1的辣 根过氧化物酶缀合的检测mAb 62(800ng)(内部标记;Roche)在37°C保溫1小时而检测。生色 团显色通过加入10化1新鲜制备的底物溶液(0-苯二胺-二盐酸化物；Sigma)而介导。使用 0.1N硫酸终止反应，记录在490nm的光密度。抗原检测限通过给出信号-噪音比为3的光密度 值确定。对于抗体检测，计算每个样品稀释液的由于阻断mAb结合的血清抗体所致0D密度降 低，使用下式计算:抑制％ =[(阴性参考血清0D-检测血清00)/(阴性参考血清0D-阳性参考 血清0D )] X 1 0 0 %。为了确定抗体检测的截断值，从新加坡的An i ma 1 He a 11 h Biotechnology Serum Bank,Temasek Life Sciences Laboratory获得无特定病原体鸡血 清、小鼠和豚鼠。
[0108] 实施例2:表征鼠单克隆抗体11B9和62
[0109] 单克隆抗体11B9和62从用A/cMcken/Malaysia/94H7Nl病毒免疫的小鼠中产生。 经鉴别mAb 11B9和mAb 62均属于同种型IgGl。除了在使用H7N1感染的MDCK细胞中阳性活性 之外，均呈现针对H7N1毒株A/cMcken/Malaysia/94的中和活性（图1A和1B)，提示其均识别 H7中的中和表位。在中和和IFA中针对不同H7毒株进一步检测两种mAb。在使用不同AIV感染 的MDCK细胞的IFA中，运两种mAb均呈现与检测的所有四种H7毒株的特异性反应，而与任何 非H7毒株无任何交叉反应(表1)。因此，mAb 11B9和mAb 62均特异于H7亚型，而与非H7毒株 无任何相互作用。在与不同AIV的中和检测中观测到相似结果。mAb 11B9和mAb 62能中和所 有四种检测的H7,而与任何非H7毒株检测到无活性(表2)，表示两种mAbs均是H7特异性中和 抗体。
[0110] 表1:在多种AIV感染的MDCK细胞中筛选单克隆抗体11B9和62
[0111]
[0114] a MAb浓度为0.1 mg/ml.
[0115] 6 100个TCID50病毒毒株用于微量中和测定。
[0116] 实施例3:针对鼠单克隆抗体11B9和62的表位作图
[0117] 由于两种mAb能中和H7病毒，使用中和化逃逸突变体选择分析参与两种mAb的表位 形成的氨基酸。A/chicken/Malaysia/94H7Nl病毒用作用于选择的亲代病毒。将分离自多个 逃逸变体的完整HA基因的序列与亲代病毒对比。发现来自mAb 11B9的突变体在氨基酸组合 136(Ser to Gly)和227(Glu突变为Gly)或者 137(Gly突变为Arg)和227(Glu to Gly)携带 双突变，而对mAb 62的突变体在氨基酸175(Lys突变为Glu)和227(Glu突变为Gly)具有双突 变。序列编号包括信号肤(表3)。
[0118] 表3:使用mAb 11B9和mAb 62通过逃逸突变的H7HA的中和表位
[0119]
[0120] 实施例4:使用mAb 11B9和mAb 62保护小鼠免于致死性病毒攻击的预防性治疗
[0121] 在用适应的H7N7病毒(A/Netherlands/219/03)攻击的小鼠中单独检验mAb 11B9 和mAb 62的预防性效力。用单一剂量的lOmg/kg任一mAb预处理的所有小鼠在用5MLD50的 H7N7病毒(A/Netherlands/219/03)致死性攻击之后均得W保护免于死亡（100%保护），而 所有未处理的对照小鼠在攻击后7天均死于病毒感染（图1A)。用单一剂量的lOmg/kg任一 mAb预处理的所有小鼠示出在病毒攻击后低于1%体重丧失。大多数运些mAb处理的小鼠在 病毒攻击后获得体重增加直至8%，而未用mAb处理的小鼠组示出在病毒攻击后显著的体重 丧失(>30%)(图 1B)。
[0122] 实施例5:抗体及抗体片段的产生
[0123] 本发明的单克隆抗体可W通过任何技术产生，所述技术允许通过培养的连续细胞 系产生抗体。运种方法包括但不限于最初由Kohler和Mi Istein在1975年掲示的杂交瘤技术 (Nature 256:495-497)，W及Ξ瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术化ozbor et al.，1983， Immunology Today 4:72)W及EBV-杂交瘤技术W产生人单克隆抗体（Cole et al.,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R丄iss, Inc.,pp 77-96(1985))。可 W使用人抗体及人抗体可W通过使用人杂交瘤获得（Cote et al.，1983，P;roc.Nat = 1. Acad. Sci . U. S. A.，80:2026-2030)，或者通过用EBV病毒在体外转化人B细胞而获得(Cole et al.,1985,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,pp.77- 96)。此外，可W使用产生"嵌合抗体"或"人源化抗体"而开发的技术(Morrison et al.， 1984,J.Bacte;riol.l59-870;Neube;rger et al.,1984,化ture 312:604-608;Takeda et al.，1985，Nature 314:452-454)，通过导入本发明的鼠抗体分子如mAb 11B9或mAb 62的序 列W及具有合适生物活性的人抗体分子的基因进行。嵌合抗体是含有人Fc部分和鼠（或其 它非人)Fv部分的那些抗体。人源化抗体是其中鼠（或其它非人)互补决定区（CDR)渗入人抗 体的那些抗体。嵌合抗体和人源化抗体是单克隆抗体。运种人或人源化嵌合抗体优选用于 人疾病或病症的体内诊断或治疗。
[0124] 根据本发明，可W调整产生单链抗体描述的技术(美国专利4,946,778)^提供本 发明的单链抗体。本发明的另一实施方案利用针对构建化b表达文库描述的技术化use et al.，1989,Science 246:1275-1281)，W使得可此陕速和简便地鉴别本发明的抗体具有希 望的特异性的单克隆化b片段或其衍生物或类似物。