r>[0125] 含有抗体分子独特型的抗体片段可W通过已知技术产生。例如，运种片段包括但 不限于:F(ab=)2片段，其可W通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生;Fab =片段，其可W通过 还原F(ab=)2片段的二硫键而产生;及化b片段，其可W通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗 体分子而产生。运种抗体片段可W从本发明的任何多克隆或单克隆抗体中产生。
[0126] 在抗体的产生中，筛选希望的抗体可W通过本领域已知的技术实现，例如放射免 疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定）、免疫放射性测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、 原位免疫测定(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标记）、蛋白印迹、沉淀反应、凝集测定 (例如凝胶凝集测定、血凝测定）、免疫巧光测定及免疫电泳测定等。在一个实施方案中，抗 体结合通过检测一抗上的标记而检测。在另一个实施方案中，一抗通过检测二抗或其它试 剂与一抗的结合而检测。在进一步的实施方案中，二抗是标记的。检测方式是本领域已知的 在免疫测定中检测结合的方式。
[0127] 实施例6:mAb 62是不同H7毒株的有效中和抗体
[0128] 针对不同H7病毒毒株的有效识别筛选流感病毒血凝素的一组Mab。基于HI测定的 结果，由于mAb 62针对禽类和人的广泛H7病毒的高HI活性(表1)而选择其做进一步研究。该 mAb属于IgGl同种型。进一步证实mAb 62病毒中和活性针对六个代表性H7毒株是阳性的，包 括一个人H7N9毒株(表4)。基于此，使用中和逃逸突变体选择分析参与形成mAb 62表位的氨 基酸。A/chicken/Malaysia/94H7Nl病毒用作用于选择的亲代病毒。将分离自多个逃逸变体 的完整HA基因的序列与亲代病毒对比。发现mAb 62的突变体携带在氨基酸175(Lys变为 Glu)或者氨基酸227(Glu变为Gly)的突变。HA的氨基酸编号从"ATG"开始，且包括信号肤。
[0129] 表4:mAb 62(100ug/ml)针对不同H7病毒的血凝抑制化I)和病毒中和(VN)滴度
[0130]
[0131] HI滴度低于8及VN滴度低于20表示阴性活性。
[0132] 为了确定mAb 62中和表位的显著性，考虑到NCBI数据库中所有H7序列，研究H7的 蛋白多态性。在第175位氨基酸，赖氨酸和天冬酷胺出现在99.9%的W上列出的H7AIV毒株 中。赖氨酸是最优势的氨基酸，在禽H7毒株中出现频率为97.9%，在人H7中频率为100%，包 括最近在中国东部爆发的H7N9毒株。运个发现提示mAb 62用于识别或中和目前鉴别的所有 H7人毒株的潜力及进一步配制为有效的H7AIV治疗剂的潜力。
[0133] 实施例7:通过单一剂量mAb 62对H7致死性攻击的有效预防性免疫
[0134] 针对5个MLD日日的H7N7病毒(A/Netherlands/219/03)攻击评估mAb 62的预防效力。 在病毒攻击前一天，小鼠组(n = 5)通过腹膜内或鼻内途径接种不同浓度(2.5mg/kg、5mg/kg 和lOmg/kg)的mAb 62。阴性对照组小鼠（仅用PBS处理)示出体重最快速的降低（25 % W上） 及在攻击后第8天死于与感染相关的并发症。通过任一途径用单一剂量mAb 62预处理的所 有小鼠均示出针对H7病毒的致死性攻击低于6% (图2A和2C)的体重丧失及100%存活率(图 2B和2D)。在粘膜施用途径中，用2.5mg/kg的mAb 62足W提供针对H7攻击的100%保护作用， 体重丧失低于5%。腹膜内施用5mg/kg的mAb 62在攻击的小鼠中能防止体重明显丧失，在经 IP施用2.5mg/kg较低剂量的小鼠中观测到6 %体重降低。
[0135] 实施例8:通过鼻内施用mAb 62的有效治疗性免疫
[0136] 评估mAb 62针对5MLD50的H7N7病毒(A/Netherlands/219/03)攻击的治疗效力。在 病毒攻击后一天，小鼠组(n = 5)通过腹膜内或鼻内途径接种不同浓度(5mg/kg、10mg/kg和 15mg/kg)的mAb 62。阴性对照组小鼠（仅用PBS处理)示出在攻击后第8天体重的最快速降低 (25% W上)及死于与感染相关的并发症。经鼻内施用单一剂量mAb 62处理的所有小鼠示出 针对致死性H7病毒攻击低于10% (图3A)的体重丧失及100%存活率（图3B)。鼻内施用5mg/ kg-15mg/kg剂量在治疗效力方面无明显差异。腹膜内施用5mg/kg的mAb 62在攻击后10天不 能保护小鼠免于死亡。在用15mg/kg较高剂量经腹膜内施用的组中，4只小鼠存活，体重丧失 15%W 上。
[0137] 实施例9:针对较高剂量H7攻击施用单一剂量与两次剂量mAb 62的治疗效力
[013引为了检测mAb 62针对较高攻击剂量lOMLDsoof H7N7的治疗潜力，将在攻击后一天 经鼻施用单一剂量的效力与经鼻施用两次(每次在不同时间点，1化i和2dpi; 1化i和7dpi)) lOmg/kg mAb 62处理的小鼠对比。在用10MLD日日的H7N7病毒（A/Netherlands/219/03)攻击 时，阴性对照组小鼠（仅用PBS处理)与用5MLD50感染相比示出体重更快速地降低(化％ W上） 及在攻击后第6天死于与感染相关的并发症。如图4A和4B示出，经鼻内用单一剂量lOmg/kg 的mAb 62处理的所有小鼠在lOMLDso感染时均存活，体重丧失大约13%。在感染后一天和两 天经鼻施用两次成功地保护所有感染的小鼠，体重丧失低于5%。此外，接受双剂量mAb 62 (1dpi和2dpi)的小鼠组当与接受单一剂量的小鼠相比时更迅速地恢复体重(8天内），施用 单一剂量的小鼠在病毒感染后10天恢复其体重。观测到在感染后1天和7天经鼻施用双剂量 的小鼠中治疗效力无增强。运个组中的小鼠与接受单一剂量的小鼠相比呈现相似的体重丧 失和恢复。
[0139] 实施例10:经鼻内途径施用mAb 62比腹膜内治疗更有效
[0140] 由于基于小鼠死亡率和体重观测到鼻内和腹膜内治疗之间的差异，因此进行进一 步研究W证实鼻内施用的更好的保护效力。对经鼻内或腹膜内用mAb 62处理的小鼠的肺进 行组织病理学研究。如图5C和5D所示，在未处理的H7N7感染的小鼠中在晚期进行性感染发 生肺部损害，包括中等至严重的坏死性支气管炎和组织细胞性肺泡炎及相关肺水肿。同时， 未感染的小鼠肺部无损害（图祀）。在感染后第14天从经鼻内用15mg/kg mAb 62处理的小鼠 中收集的肺示出无肺病理学改变，与未感染的对照组看起来相似（图5A)，而在用15mg/kg of mAb 62经腹膜内处理的小鼠的肺中存在中等支气管炎（图5B)。
[0141] 此外，在H7感染的或处理的小鼠中评估肺中的病毒荷载。病毒复制的动力学通过 在感染后第2、4、6和14天测量小鼠肺中病毒滴度而确定（图6)。当在感染的但未处理的小鼠 中检测到大于l〇7'is的最高病毒滴度时，病毒滴度在病毒攻击后第6天最高，小鼠在随后的2 天内死亡。用单一剂量的15mg/kg的mAb 62经鼻内处理的小鼠示出在感染后第2天病毒荷载 降低。然而，用相同抗体剂量经腹膜内处理运些小鼠示出仅在感染后第6天病毒荷载降低。 腹膜内处理的小鼠中病毒滴度在每个时间点均高于鼻内处理组，表示鼻内处理从感染开始 时降低病毒荷载。所有运些发现证实用mAb62的鼻内治疗比腹膜内治疗对于H7N7HPAI病毒 更有效。
[0142] 实施例ll:mAbs 62和11B9识别H7AIV上保守的中和表位
[0143] 筛选针对流感病毒血凝素的一组mAbW有效识别不同的H7病毒毒株。基于HI测定 和病毒中和化结果(表5)，基于其针对来自禽类和人的广泛H7病毒、包括最近在中国东部爆 发的H7N9毒株的高HI活性而选择mAb 62和mAb 11B9进一步研究。运两种mAb均属于IgGl同 种型。mAb 62和mAb 11B9的病毒中和活性进一步证实是H7AIV阳性的。基于此，使用中和逃 逸突变体选择分析参与形成mAb 62和mAb 11B9的表位的氨基酸。A/chicken/Malaysia/ 94H7N1病毒用作亲代病毒W进行选择。分离自多个逃逸变体的完整HA基因的序列与亲代病 毒对比。发现用mAb 62产生的突变体携带在氨基酸175(Lys突变为Glu)或氨基酸227(Glu突 变为Gly)的突变。mAb 11B9携带在氨基酸136(Ser突变为Gly)或氨基酸137(Gly突变为Arg) 或氨基酸227(Glu突变为Gly)的突变。HA上氨基酸编号起自"ATG"，并包括信号肤。
[0144] 表5:mAb 62和mAb llB9(200μg/ml)针对不同H7病毒的血凝素抑制化I)和病毒中 和(VN)滴度，与任何其它亚型无任何交叉反应性
[0145]
[0146] HI滴度低于8及VN滴度低于20表示阴性活性。*:野生型病毒。
[0147] 为了确定mAb 62和11A9的中和表位的显著性，考虑到NCBI数据库中的所有H7序 列，研究H7的蛋白多态性(表6)。在第175位氨基酸，赖氨酸和天冬酷胺出现在99.9%的W上 列出的H7AIV毒株中。赖氨酸是最优势的氨基酸，在禽类H7毒株中出现频率为97.9%，在人 H7中出现频率为100 %。在第136位氨基酸，丝氨酸在96.6 %禽类毒株中存在，在人H7毒株中 100%存在，而在137位氨基酸的甘氨酸在禽类H7中99.9%存在及在人毒株中100%存在。运 个发现表明运两种mAb均能识别或中和目前鉴别的所有H7人毒株，提示其用于通用H7AIV检 测的潜力。
[0148] 表6:在人和禽类H7毒株中的表位频率
[0149]
[0150] 实施例12:双功能化ISA的开发
[0151] 如图7所示运行双功能化ISAdH7抗原可W在基于H7特异性mAb的AC-ELISA中检测。 由于其在H7AC-ELISA中可逆应用的等价效能，随机选择mAb 62作为检测抗体，mAb 11B9用 作捕获抗体。mAbs 62和11B9的检测和捕获的最佳浓度通过mAb双向滴度确定。提供最高信 号-噪音比的组合确定为0.化g/孔的捕获mAb 11B9及0.化g/孔的检测mAb 62。当吸光度比 非H7病毒的吸光度高Ξ倍时，认为双功能ELISA中检测的病毒是H7抗原阳性的。
[0152] H7的血清抗体可w通过其在化ISA测定封闭由H7特异性mAb对祀表位的识别的能 力而检测。为了将运个测定与AC-ELISA组合，将血清样品与固定量的重组杆状病毒保溫，所 述重组杆状病毒在病毒表面展示H7,之后加样于用捕获mAb包被的平板。样品中H7抗体滴度 基于检测到的H7杆状病毒的降低而确定。检测不同浓度的H7杆状病毒，证实在細AU的最佳 浓度。来自正常或H7免疫的鸡和小鼠的血清组用于确定截断值。首先，使用来自无 H7抗体的 16只鸡和20只小鼠的一组正常血清样品确定在双功能化ISA中mAb 62结合H7抗原的非特异 性降低的基线。对于运组血清，双功能化ISA读数平均降低6.5%，标准差(SD)为7.1。如果针 对血清样品设定"截断值"含30%，特异性封闭活性可WW95%置信度确定。截断值通过3SD 加上平均6.5 %封闭而获得(6.5+21.3 = 27.8 % )。在检测中，当呈现> 30 %信号封闭率时， 记录每个血清样品的稀释倍数。此外，记录稀释20倍的每个样品的封闭率进行对比。
[0153] 实施例13:通过双功能化ISA的H7抗体检测的特异性和灵敏度
[0154] 通过双功能化ISA的H7抗体检测的特异性使用来自不同地区和年份的人和禽类的 6个H7毒株及13个代表性非-H7亚型流感病毒毒株进行检测，包括在人中循环的流行性感冒 和禽流感毒株（图8)。我们实验室没有的H7或HA亚型病毒使用6个A/Puedo Rico/8/34的内 部基因通过反向遗传学捶救。在双功能化ISA中的H7抗原检测的反应性和特异性使用10化1 的含有H7毒株的PBS检验，调节为HA滴度为8。使用HA滴度M6的非H7病毒W消除假阳性结 果。针对检测的任何非H7亚型病毒没有观测到交叉反应性。
[0155] 在双功能化ISA中H7抗原检测的分析灵敏度针对四种不同的H7毒株确定，所述毒 株的吸光度范围在8HAU是0.7-1.3(图9)。将Ξ个选择的H7病毒系列稀释W基于HA滴度确定 检测限。在0.2的截断值，对于具有平均吸光度和高于平均吸光度的病毒，检测限确定为100 μ1样品含有1HA滴度的病毒，而对于具有低于平均吸光度的病毒为2HA滴度。对于流感病毒 的HI检测的检测限确定为2HAU( 10化1)，观测到亚型交叉反应性。实施例14:通过双功能 ELISA的H7抗体检测的特异性
[0156] 通过双功能化ISA的H7检测的特异性使用来自实验性免疫的鸡、小鼠和豚鼠的一 组抗血清研究。在第二次免疫后10天收集动物血清，首先稀释获得对于同源病毒的HI滴度 为16, W标准化抗体浓度，之后用于邸-ELISA中。用H7N1流感病毒免疫的鸡的血清（图10)呈 现出>85%的mAb 62结合抑制，而用化-H6和册-H13免疫的鸡血清示出最大封闭率10%，低 于针对含有H7特异性抗体的样品确立的30%阔值。在用野生型杆状病毒免疫的血清中检测 到无抑制。在用4种不同H7毒株单独免疫的所有小鼠血清中也观测到阳性抑制，表明该测定 特异于检测H7抗体。H7免疫的所有动物血清，包括鸡、小鼠和豚鼠，在双功能化ISA中均示出 阳性封闭，表明该测定对于来自任何物种的血清均有效。运些结果表明在双功能化ISA中的 抗体检测可W阳性鉴别含有H7抗体的血清样品，而与其它亚型的血清无任何交叉反应。
[0157] 实施例15:通过双功能化ISA的H7抗体检测的灵敏度
[015引在双功能化ISA中H7抗体检测灵敏度主要通过对比病毒中和和HI而确定，使用纯 化的mAb 62进行。如表7所示，在双功能化ISA中，4化g的mAb 62足W达到相应于封闭率超过 30%的终点，而需要至少160叫的相同11146 62^中和1001'(：1050的^^^/化1}16^曰11(13/ 219/03)病毒或者抑制血凝反应。在抗体检测中进行另外的双功能化ISA与病毒中和对比， 使用H7免疫的小鼠血清进行(表8)。在用变体H7AIV毒株仅一次免疫后的小鼠血清针对H7N7 (A/Netherlands/219/03)的中和滴度范围是40-320。在双功能化ISA中检测相同批次的血 清，其中终点滴度范围为100-1000。通过任一检测对于预先免疫的血清样品检测到无阳性 活性。对比表明双功能ELISA能检测较低浓度的H7特异性抗体及比病毒中和呈现较高的信 号滴度。
[0159 ] 表7:基于中和mAb的抗体检测、HI和微量中和测定中双功能化ISA的检测限 [0160]
[0161] 每种检测的检测限度W粗体字和斜体字表示。
[0162] 表18:在使用单一 H7免疫后合并的小鼠血清的抗体检测中双功能化ISA与病毒中 和之间的对比
[0163]
[0164] 描述本发明的文本中使用的术语"一(a)"、"一(an)"、"所述"（特别是如下权利要 求书中），除非特别指出或者在上下文义中矛盾，均解释为包括单数和复数形式。除非特别 指出，术语"包含"、"具有"、"包括"及"含有"解释为开放式术语（即是指包括但不限于）。除 非特别指出，本文列举的数值范围仅仅是在运个范围内单独的每个单独数值的速记方法， 每个单独的数值如单独列举其一样均包含在本说明书中。例如，如果掲示的范围是10-15， 则也掲示了 11、12、13和14。除非特别指出或在上下文义明显矛盾，本文所述所有方法均可 W任何适当顺序进行。除非特别要求，本发明提供的任何和所有实施例或举例的用于(例如 "如"）的应用，是为了更好地例证本发明，无限制本发明范围之意。本说明书中没有用语应 被解释为表示任何没有要求保护的元素是实施本发明必需的。
[0165] 应意识到本发明的方法和组合物可W渗入各种实施方案形式中，本文只是描述了 其中一小部分。本发明的实施方案在本文描述，包括本发明人已知的进行本发明的最佳模 式。本领域技术人员在阅读前文描述之后可显然了解运些实施方案的变化。本发明人期望 技术人员适当地应用运些变化，及本发明人希望除了如本文特别描述之外实施本发明。因 此，本发明包括在所附权利要求书中列举的主题由适用法律允许的的所有修饰和等价物。 此外，除非特别指出或者另外在上下文义中显然矛盾之外，在所有可能变化中的上述元件 的任何组合均涵盖在本发明中。
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