Qilture Collection(ATCC)。还使用了两种其他的 非神经胶质瘤细胞系，包括MCF-7(乳腺癌)和Τ24(膀脫癌）。对于每个细胞系所使用的培养 基和补充物根据ECACC和ATCC的建议。将所有细胞系保持在具有5%C02和75cm2组织培养瓶 (Thermo Scientific Nune，UK)的37°C加湿培育箱中。当细胞系达到70-80%汇合时收获细 胞系，并在第5-25代之间使用。
[0062] 细胞摄取和定位：
[0063] 共聚焦显微术：
[0064] 培养神经胶质细胞系（1321N1、U87MG、T98G和SVGp 12)、乳腺癌细胞系(MCF-7)和膀 脫癌细胞系(T24)并WlxlO4个细胞/ml (在用FBS和青霉素/链霉素混合物补充的它们的单 独培养基中）的接种密度接种在24孔板的盖玻片上。然后将汇合的细胞系与特定浓度的适 体在37°C下解育90分钟。然后将细胞用PBS洗涂3次W去除未结合的适体。然后将细胞用4% 多聚甲醒(PFA)在室溫下固定15分钟。在固定之后，将细胞用具有DAPI的VECTASHIELD封固 介质（Vector laboratories,UK)复染W对细胞核染色。使用Zeiss LSM 510META共聚焦显 微镜应用相同的仪器设置(放大器增益：1，检波器增益：1092,放大器偏移:-0.06)来获取与 细胞结合的适体的图像。
[0065] 流式细胞术测定
[0066] 允许神经胶质细胞系（1321化、118716、了986和5￥6912)、乳腺癌细胞系(1〔。-7)和膀 脫癌细胞系（T24)在24孔板上生长直至其达到80%汇合。将细胞用lx PBS洗涂并与合适浓 度的适体一起在37°C巧％C〇2)下解育90分钟。随后将细胞用lx PBS洗涂3次，接着添加 lx膜 蛋白酶到每个孔中并在37°C下解育2分钟，W使粘附细胞脱附。在膜蛋白酶处理2分钟之后， 溫和地轻拍孔板并在倒置光学显微镜下观察，W确保细胞的脱附。然后加入0.3ml体积的培 养基，并且然后将细胞悬浮液转移至微量离屯、管。然后W224g对细胞离屯、5分钟。在离屯、之 后，将上清液吸出，并且然后轻弹细胞块并用30化1的lx PBS重悬并充分混合，且备用于流 式细胞分析。在使用在488nm处激发且在578nm处发射的PE(藻红蛋白）激光器的流式细胞仪 上来进行分析，其中对每个样品收集10，000个事件。
[0067] 使用生物素标记的适体的免疫组织化学：
[0068] 本研究还包括对来自BTNW库的来自45名不同患者的具有不同神经胶质瘤级别(包 括I级、Π 级、III级、IV级胶质母细胞瘤和非癌性脑)的一系列组织切片进行适体筛选。
[0069] 对于适体染色，每个离体肿瘤组织样品和非肿瘤部分由来自医院的病理学家固定 并连续地切片(4mm)，作为福尔马林固定、石蜡包埋的切片。将运些石蜡包埋的组织切片用2 次化stoclear更换(每次15分钟)来脱石蜡，并通过梯度乙醇(每个浓度5分钟)再水化。将组 织切片用蒸馈水冲洗，并然后在97°C下经受用0.01M巧樣酸盐缓冲液的抗原修复步骤，持续 20分钟，然后进行实验。将切片在PBS中冲洗两次，每次2分钟。为了遮蔽内源性生物素结合， 遵照制造商的说明，将切片用生物素封闭溶液(Vector laboratories)处理30分钟，并然后 用PBS洗涂3次。然后将组织切片与lOOnM生物素标记的适体一起在室溫下解育60分钟。然后 将切片用PBS洗涂3次，每次洗涂5分钟。然后将切片与VEGTASTA1N" ABC试剂一起在室 溫下解育30分钟。在用PBS溶液洗涂Ξ次之后，随后将组织切片用20化1的DAB过氧化物酶底 物溶液(Dako)在室溫下处理lOminW显色。遵照常规实验室方案用苏木精溶液对组织切片 中的细胞核进行复染色，持续5分钟，W使切片脱水并封固。然后在光学显微镜下检查经处 理的组织。
[0070] 针对细胞系筛选cy3标记的适体
[0071] 将适体SA44(GL44)、SA43(GL43)、SA56(GL56)、对照适体CL44和"neg"用切3巧光染 料标记。针对细胞系筛选标记的适体的结合，并利用Z堆找和3D共聚焦成像来分析它们的结 合特异性。在图1中展示了图示共聚焦成像的结果的代表性显微照片。
[0072] 结合W下细胞系调查了适体的结合：
[0073] ?USTMG-源自IV级神经胶质瘤的细胞
[0074] ?USlnl-源自II级神经胶质瘤的细胞 [00巧]?SVGpl2-非癌性胎儿星形胶质细胞
[0076] 参了986-来自IV级神经胶质瘤的细胞，尽管与U87MG相比较少致瘤
[0077] 参了24-膀脫癌细胞系的细胞 [007引 >MCF7-乳腺癌细胞系的细胞
[0079] 与非癌性SVGpl2细胞相比，适体SA44(GL44)和SA43(GL43)显示出对U87MG神经胶 质细胞系较高的结合能力。如在图1中可W看出的，适体对癌性细胞而不是非癌性细胞是选 择性的。
[0080] 还使用流式细胞术定量了加 Cy3标签的适体SA44(GL44)、SA43(化43)和SA56 (GL56)与细胞系的结合。在图2中示出了得到的结果的代表性图。观察到相同的适体结合模 式，对U87MG细胞具有特异性，对SVGp 12细胞则相反。
[0081 ]本发明的适体到神经胶质瘤细胞的主动摄取
[0082] 调查本发明的适体被神经胶质瘤细胞主动摄取的研究结果被示于图3中，且在该 图中示出的结果被归纳于图4中。
[0083] 简单来说，图4图示了当本发明的适体与神经胶质瘤细胞系的细胞一起在4°C下解 育时，基本上没有适体被摄取入细胞中。但是，当适体与相同细胞系的实例一起在37°C下 (在该溫度下细胞的代谢过程是活跃的)解育时，适体(在此参考SA44或SA43被图示)被摄取 入细胞内。该主动摄取(其结果被归纳于图4中）代表了有用的过程，通过该过程本发明的适 体能够进入神经胶质瘤细胞中，与运些适体在治疗或诊断(诸如标记)应用中的使用一致。
[0084] 组织的标记
[0085] 将本发明的适体(如W上列出的）、对照适体化44或"neg"阴性对照适体用于标记 非癌性脑组织的组织学切片，W及从I至IV级神经胶质瘤采集的组织切片。
[0086] 总的来说在W下中调查了运些适体(本发明的适体、对照和"neg"适体）中的每一 个的结合：
[0087] ?非癌性脑的9个样品，
[0088] 参1级神经胶质瘤的7个样品，
[0089] 参11级神经胶质瘤的9个样品，
[0090] ?HI级神经胶质瘤的10个样品，和
[0091] >?ν级神经胶质瘤的10个样品。
[0092] 在图5中展示了示出该标记的结果的代表性显微照片。该图的每幅图图示了不同 适体(本发明的适体、对照或neg适体)在非癌性脑或来自I-IV级神经胶质瘤的样品中的标 记。
[0093] 适体的特异性结合通过在标记的部位产生暗染色来图示。样品内的细胞核通过苏 木精复染来可视化。
[0094] 通过查看附图，可W看出与非癌性组织相比，在神经胶质瘤中用本发明的适体(而 非对照或neg适体)标记的细胞增加，且标记程度随神经胶质瘤级别的增加而升高。
[00M]来自 I级(η = 7)、Π 级(n = 9)、III级(n=10)、IV级(n=10)和非癌性脑(n = 9)的45 个不同的初级组织用生物素标记的适体来筛选，并利用已建立的IHC评分系统来定量，其详 细信息在表1中示出。含3的总得分被认为是可忽略不计的结合。
[0096] 表 1
[0097]
[0098] ~~为了确定统计学差异，对流式细胞术数据进行K-S和化apiro-Wnk正态性检验，并' 利用Mann-Witney检验来分析结果。对于组织切片，进行Fisher精确检验，从而总得分高于3 的组织切片被认为是阳性的。
[0099] 运些统计学分析的结果在表2中示出，其中P<0.05被认为是统计学上显著的。
[0100] 表2
[0101]
[0102] 实验结果2
[0103] W上描述的研究通过加入3个另外的非癌性患者组织样品和5个另外的II级神经 胶质瘤患者组织样品来扩展，W给出W下的组：
[0104] ?非癌性脑的12个样品，
[0105] 参1级神经胶质瘤的7个样品，
[0106] 参11级神经胶质瘤的14个样品，
[0107] ?HI级神经胶质瘤的10个样品，和
[0108] >?ν级神经胶质瘤的10个样品。
[0109] 该扩展组的统计学分析提供了本发明的适体区分如在表3中所列出的非癌性脑或 来自I-IV级神经胶质瘤的样品的能力的进一步说明。
[0110] 表3
[0111]
[0113] 图6图示了SEQ ID NO: 2(GL43)的