征测序片段。按以上方法，分别获得了目标微 生物类群和目标微生物的特征区域的特征片段数，其结果列于表1。在本实施例中，nl和n2 的值见表2,其推算过程见后。
[0077] nl使得Pl^al且Ρ3<α3,其中，P1为一条不是目标微生物类群的特征测序片段的 高通量测序片段被误判为目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性的概率;Ρ3为一 条目标微生物类群的特征测序片段被误判为不是目标微生物类群的特征测序片段而产生 的假阴性的概率;α?和α3为判断阈值。
[0078] η2使得Ρ2 < α2且Ρ4 < α4,其中，Ρ2为一条不是目标微生物的特征测序片段被误判 为目标微生物的特征测序片段而产生的假阳性的概率;Ρ4为一条目标微生物的特征测序片 段被误判为不是目标微生物的特征测序片段而产生的假阴性的概率;α2和α4为判断阈值； 本发明实施例中的各种阈值的大小由现实需要确定，例如，某些病菌危害性极大，漏检(假 阴性)将引起严重的后果，那么，就要控制假阴性，α2和α4值要低。若无特殊要求，则采用较 低假阳性与假阴性为原则，本实施例子属于后者，α?和α3取值为0.01%，即大约1万条特征 序列出现1条假阳性或假阴性，其准确性是很高的，之所以可以控制如此高的准确性，是因 为特征序列中的ml值较大，很容易与其它非目标生物区分开，从而将假阳性率与假阴性率 都控制在一个很低的水平。α2和α4的取值为0.5%，即大约1千条特征序列出现5条假阳性或 假阴性，可见其准确性很高。Pl=BINOM.DIST(nl，ml，l-E，TRUE)，P2 = BINOM.DIST(n2，m2, 1-E，TRUE)，P3 = l-BINOM.DI ST(nl，Ll，E，TRUE)，P4=l-BINOM.DIST(n2，L2，E，TRUE)，其 中，ml为区分度，具体指用于计算SI的目标微生物类群的特征区域对应的区分度，本实施例 中，ml的值见表1和表2 ;m2为目标微生物的特征区域与目标微生物类群的其它微生物间差 异碱基的最小值，具体指用于计算S3的目标微生物对应的特征区域的m2的值，本实施例中， m2的值见表1和表2; L1为目标微生物类群的特征区域的长度，本实施例子中，L1的值见表2; L2为目标微生物的标准基因型的长度，本实施例子中，L2的值见表2; E为碱基错误率，其由 测序错误率E1和自然突变率E2组成，本实施例中，PROTON高通量测序仪的测序错误率E1 < 1%，根据我们的调查，微生物小种(如P1-P6白叶枯小种）的参考基因组之间的变异率一般 小于0.5%，而自然突变率是低于小种间的变异率的，因此，自然突变率E2 < 0.5 %，为了本 发明的方法适应性更广，取E2 < 1 %，则本实施例中，E < 2%，为了使得本实施例中微生物的 定性与定量的结论正确率的概率更可靠，取E值的最大值2%进行计算。将以上参数值代入 P1和P3的公式中后，将η 1的值从0开始逐渐增加，计算得P1和P3的值，当η 1 = 13时，计算得P1 <€(1且?3<€[3，因此，本实施例中，111 = 13(见表2)，111 = 13对应的？1和?3的值为本实施例中 Ρ1和Ρ3的值。按类似的方法，将以上参数值代入Ρ2和Ρ4的公式中后，将η2的值从0开始逐渐 增加，计算得Ρ2和Ρ4的值，当η2 = 2时，Ρ2 < α2，Ρ4 < α4，因此，本实施例中，η2 = 2(见表2)，η2 =2对应的Ρ2和Ρ4的值为本实施例中Ρ2和Ρ4的值。
[0079] 将参考微生物作为仅包含一个目标微生物的目标微生物类群，计算获得的目标微 生物的特征测序片段，即为参考微生物的特征测序片段。参考微生物的特征区域的特征片 段数见表1和表2。
[0080] 若目标微生物类群的特征测序片段存在的概率Ρ5 2 α5，则判断待测样品中存在目 标微生物类群;若目标微生物类群的特征测序片段存在的概率Ρ5〈α5，则判断待测样品中不 存在目标微生物类群，其中，α5为概率保障，本实施例中，α5取值为99.99%。？5 = 1-BIN0M.DIST(S1，S1，P1，FALSE)，S1为所有的目标微生物类群的特征区域的目标微生物类群 的特征测序片段的数量的中位数，在本实施例中，目标微生物类群的第2个特征测序片段的 数量为所有目标微生物类群的特征测序片段的数量的中位数，所以本实施例S1的值见表1 和表2,将本实施例中S1的值和P1的值代入P5的计算公式计算获得P5 2 α5,因此，判断本实 施例中，待测样品中存在目标微生物类群，FALSE为参数值，ΒΙΝ0Μ.DIST函数返回一元二项 式分布的概率。
[0081] 若目标微生物的特征测序片段存在的概率P6 2 α6，则判断待测样品中存在目标微 生物;若目标微生物的特征测序片段存在的概率Ρ6〈α6，则判断待测样品中不存在目标微生 物;α6为概率保障。本实施例中，α6取值为99.99%。Ρ6 = 1-ΒΙΝ0Μ.DIST(S3，S3，Ρ2，FALSE)， BINOM.DIST函数返回一元二项式分布的概率，S3为所有的目标微生物的特征区域的目标微 生物的特征测序片段的数量的中位数，在本实施例中，目标微生物的第2个特征测序片段的 数量为所有目标微生物的特征测序片段的数量的中位数，其对应的S3的值见表1和表2,将 本实施例中S3的值和P2的值代入P6的计算公式计算获得P6 2 α6，因此，判断本实施例中，待 测样品中存在目标微生物。
[0082]此外，α5和α6均是人们根据实际需要定的，α5和α6均可以相同也可以不同，其区别 取决于实际需要，当要严格控制某种微生物时，α5和α6的取值均较大，反之，α5和α6的取值 均较小。此外，本发明实施例中所有的a值的取值均遵循该原理。
[0083]定量分析方法如下：目标微生物类群的量Ml =MrXSl/S2,其中，Mr为加入待测样 品中的参考微生物的量，本实施例中，Mr的值见表2;S2为所有的参考微生物的特征区域的 参考微生物的特征测序片段的数量的中位数，在本实施例中，参考微生物的第2个特征测序 片段的数量为所有参考微生物的特征测序片段的数量的中位数，其对应的S2的值见表1和 表2;将以上参数和通过定性分析获得的S1的值代入Ml的计算公式中，计算获得Ml值，即待 测样品中，目标微生物类群中的微生物的量为Ml =85个。
[0084]目标微生物类群的量的置信区间为[M11，M12]，M11和M12分别为Ml值的置信区间 的下限与上限。M11=M1 X (1-S4/S1)，M12 = M1 X (1+S5/S1)，其中，S4为假阳性的目标微生 物类群的特征测序片段的数量且S4 = CRITBIN0M(nS，Pl，a9)，S5为假阴性的目标微生物类 群的特征测序片段的数量且S5 = CRITBIN0M(S1，P3，a9)，其中，a9为概率保障，本实施例中， 〇9取值为99.50%，0?1了8預0 1函数返回使累积二项式分布大于等于临界值的最小值，1^为 计算S1的目标微生物类群的特征区域的多重扩增引物所扩增的非特征区域的高通量测序 片段的数量，即是指多重引物所扩增的除目标微生物的特征测序片段之外的其它高通量测 序片段。在本实施例中，nS为目标微生物类群中第2个特征区域的多重扩增引物扩增所产生 的非特征区域的高通量测序片段的数量，本实施例中，nS的值见表2。将nS的值和P1的值代 入S4的公式计算获得S4的值，将本实施例S1的值和P3的值代入S5的公式计算获得S5的值。 获得Mil和M12公式中所有参数的值后，计算获得本实施例中Mil和M12的值，进而获得Ml的 置信区间，即目标微生物类群的量的置信区间为[85，85]。
[0085]目标微生物的量M2 = M1XS3/S1，将M1、S3和S1的值代入上述公式，获得目标微生 物的量M2 = 24个。
[0086]目标微生物的量的置信区间为[M21，M22]，M21和M22分别为M2值的置信区间的下 限与上限;M21=M2 X (1-S6/S3)，M22=M2 X (1+S7/S3);其中，S6为假阳性的目标微生物的 特征测序片段的数量且S6 = CRITBIN0M(S1，P2，al〇)，S7为假阴性的目标微生物的特征测序 片段的数量且S7 = CRITBINOM(S3，P4，al〇)，其中，al〇为概率保障;CRITBIN0M函数返回使累 积二项式分布大于等于临界值的最小值。本实施例中，alO取值为99.50%，将本实施例S1和 S3的值，以及P2和P4的值代入S6和S7的计算公式，计算得到S6和S7的值。进一步将S6、S7、M1 和S3的值代入M21和M22的计算公式，计算得到M21和M22的值，进而得到目标微生物的量的 置信区间为[22,24]。
[0087]表2为本实施例一提供的微生物定性与定量分析参数及其推算原理
[0088]
[0089」买施例二、生菜污染微生物的鉴定
[0090]本实施例中的待测样品为武汉沌口市场购买的生菜，检测待测样品中可能污染的 微生物可以确定食用该生菜特别是不煮熟食用是否安全。本发明实施例二与实施例一的方 法类似，没有提及的方法、参数与结果与实施例一相同。
[0091 ]步骤一、确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存 在于待测样品中的参考微生物，具体方法与结果同实施例一。
[0092]步骤二、根据目标微生物类群的参考基因组序列、目标微生物的参考基因组序列、 参考微生物的参考基因组序列和非目标生物的参考基因组序列，获得目标微生物类群的特 征区域、目标微生物的特征区域和参考微生物的特征区域，具体方法与结果同实施例一。
[0093] 其中，将目标微生物从目标微生物类群中区分出来，其原理见表4。
[0094] 步骤三、制备扩增目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增目标微 生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物， 将第一多重扩增引物、第二多重扩增引物和第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引 物，具体方法同实施例一，结果见表3。
[0095] 表3本实施例二提供的引物相关信息
[0096]
[0097] 步骤四、向待测样品中加入参考微生物，获得混合样品，具体方法如下：
[0098]将浓度为20D(0D为菌液最大吸光度值）的参考微生物的菌液0.2mL置于1.5mL的离 心管中真空冷冻离心干燥后，加入lOOmg待测样品即生菜中，加入液氮后研磨成粉状，即得 到待测样品与参考微生物的混合样品。通过血球板计数，计算获得加入混合样品的参考微 生物的量见表4。
[0099] 步骤五、提取混合样品的核酸，具体方法如下：
[0100] 待测样品为生菜，其核酸含量正常，因此，不需要向混合样品中加入外源核酸。利 用植物基因组DNA提取试剂盒(货号:DP305,生产公司：天根生化科技(北京)有限公司）按其 操作手册提供的方法提取获得的混合样品的核酸。
[0101]步骤六、利用混合多重扩增引