[0033] PCR反应可W精确地控制产物的长度，但用PCR直接标记探针的效率不高，而且很 多用于PCR反应的酶都不能有效地将标记的加 TP渗入到产物中去。PCR反应也不能用于标记 RNA探针。
[0034] 本发明是利用PCR反应可W精确控制产物长度的特点，用其制备多个的理想长度 的DNA片段作为模板去标记探针，运样在DNA模板水平就有效地控制了标记的探针长度，审U 备的RNA探针不用RNA碱裂解或DNA酶处理过程而直接用于杂交反应。此外，用多个的理想长 度的DNA片段作为模板，还能根据检测目的的需要而有效地覆盖特定的目标基因序列。同时 在每一个引物末端加上RNA聚合酶结合序列，使多个的理想长度的DNA片段可同时在同一标 记反应中作为模板可W制备RNA探针。
[0035] 下表1比较了常规制备探针的方法与本发明所述的方法的异同。
[0037] 本发明所述的方法有利于筛选和制备高特异性探针，并可消除非编码序列及其它 非特异性序列的影响。多重DNA片段的设计对检测序列更有针对性，不仅排除了一些非编码 序列及其它非特异性序列，也能使探针的特异性大大提高。
[0038] 本发明所述的方法有利于区分同源性序列及RNA的不同剪切形式。本发明多重DNA 片段的设计可根据检测对象来确定加入或删除一些同源性序列，也可W只包含或不包含不 同剪切形式而达检测特异性目标序列的目的。
[0039] 此外，本发明中设计引物时，在反向引物5'端加上启动子序列或RNA聚合酶结合序 列，可确保每个片段都能转录成探针，针对目标序列设计多对引物，能够保证探针覆盖祀基 因所有特异的区域。
【附图说明】
[0040] 图1是WMIC-I CRNA为模板设计、制备及标记RNA探针的原理示意图。首先根据目 的序列MIC-I CRNA序列设计引物，引物的5'端加上T7启动子序列;再用PCR方法分别扩增出 目的DNA片段并纯化；W混合的PCR产物作为标记模板，进行RNA聚合酶反应，将带有生物素 标记的UTP渗入产物中，纯化后即得到RNA探针。
[0041] 图2是采用本发明所述方法制备的RNA探针在FI甜中的实验结果。用生物素标记的 MIC-I cRNA探针检测人膜腺癌细胞SW1990的MIC-ImRNA表达水平。
【具体实施方式】
[0042] 实施例一：WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针
[0043] WMIC-I CDNA为模板制备RNA探针的过程参见图1。
[0044] 一、PCR引物的设计：
[0045] (1)在GeneBank化t1:p: //ww.ncbi .nlm.nih. gov/genbank/)中查找MIC-I mRNA序 列，用NCBI BLAST化ttp: //blast. ncbi . nlm.nih. gov/Blast. Cgi)排除其它非特异性RNA序 列。
[0046] (2)筛选2个无内含子和重复序列特定序列区域，排除同源区域序列。
[0047] (3)所选的每个区域各设计一对引物，使扩增产物长度为200-5(K)bp。
[004引引物的设计：
[0050] 上表所设及的引物仅仅是举例，本领域技术人员可W根据本发明的原理设计出更 多的合适的引物。
[0051] (4)将T7启动子序列加在反向引物的5'端，W确保PCR产物与目的片段互补并包含 全部祀序列。
[0化2] T7启动子序列：5 ' -TAATACGACTCACTATAG-3'
[0053] T7启动子序列可W用同类型的SP6启动子序列、T3启动子序列或Trc启动子序列替 代。
[0054] 二、标记模板的制备:通过PCR从cDNA质粒模板(GeneCopoeia cDNA质粒库），扩增 带有T7启动子的目的片段。
[0化5] S、RNA探针的制备：
[0056] 配置10 XNTPs,其中，ATPXTP和GTP的浓度均为IOmM,UTP的浓度为3.5mM。在一个 RNase-free(无 RNA酶）的EP中，在RNase-打ee的环境中操作，加入W下成分：
[0化引 （1)混匀反应液，于37 r下反应2-化。
[0059] (2)加入化L面ase KDNA聚合酶I)和扣L面ase I buffer(DNA聚合酶I缓冲液）， 混匀后于37°C下15min，W除去模板DNA。
[0060] (3)加入化L 0.5M邸TA(PH 8.0)(乙二胺四乙酸），65°(：下反应1〇111111^终止反应。
[00川 （4)取2-3化的产物电泳检测，缓冲液用1 XM0PS(3-吗嘟丙横酸）。
[0062] (5)加入10化L DEPC(焦碳酸二乙醋)水，150化苯酪和20化L氯仿至EP管中，震荡混 匀，10000巧m 离屯、IOmin。
[0063] (6)上清液转移至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀静置IOmin后，12000rpm 离屯、lOmin，去上清。
[0064] (7) 75 %的酒精洗涂沉淀后，力阳EPC(焦碳酸二乙醋)水溶解，测产物浓度并电泳检 测，保存于-20°C。
[0065] 由此，得到WMIC-I cDNA为模板制备的RNA探针。
[0066] 将上述方法得到的生物素标记的MIC-I CDNA探针用于检测人膜腺癌细胞SW1990 (购自ATCC)的MI C-ImRNA表达水平。
[0067] 在巧光显微镜下观察，实验结果如图2所示。左图：用DAPI即4'，6-二脉基-2-苯基 吗I噪(4'，6-diamidin〇-2-地enylindole)染色，蓝色巧光显示细胞核。中图：用所述探针与 目的mRNA杂交，红色巧光显示人膜腺癌细胞SW1990的MIC-ImRNA分布及表达水平。右图为左 图与中图的合成图像，直观地显示细胞核与MIC-ImRNA的相对位置。
【主权项】
1. 一种以MIC-lcDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤： A. 针对MIC-lmRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物 的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列； B. 从MI C-1 cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯 化后混合，作为模板； C. 加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA 探针。2. 根据权利要求1所述的以MIC-lcDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5 '端加上T7启动子序列。3. 根据权利要求1所述的以MIC-lcDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上SP6启动子序列。4. 根据权利要求1所述的以MIC-lcDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是T3RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上T3启动子序列。5. 根据权利要求1所述的以MIC-lcDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，所述 RNA聚合酶是Trc RNA聚合酶，引物的5 '端分别加上Trc启动子序列。6. 根据权利要求1所述的以MIC-lcDNA为模板制备RNA探针的方法，其特征在于:所述步 骤A中，所述筛选包括:筛选2-50个无内含子和重复序列的特定目标序列区域，根据需要可 选择同源区域序列，作为靶序列。7. -种快速检测肿瘤相关的MIC-1表达的试剂盒，其特征在于：包括根据权利要求1所 述的方法所制备的RNA探针。
【专利摘要】本发明涉及一种以MIC-1cDNA为模板制备RNA探针的方法。该方法包括：针对MIC-1mRNA序列筛选多个靶序列，对于每个靶序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；从MIC-1cDNA质粒中，采用上述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。本发明得到的cRNA探针能够全部覆盖所有靶序列，即MIC-1mRNA序列。本发明探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，探针特异性和稳定性更强，背景信号更低且灵敏度更高。在此基础上，本发明提供了一种快速检测肿瘤相关的MIC-1表达的试剂盒。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/10, C12N15/11
【公开号】CN105603093
【申请号】CN201610087432
【发明人】徐学明, 鲁隼, 冯俊清
【申请人】广州复能基因有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月16日