Ssr与snp两种分子标记配合使用进行玉米辅助高效育种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，设及SSR与SNP两种分子标记 配合使用进行玉米辅助高效育种的方法。
【背景技术】
[0002] 玉米常规育种是通过表型观察选择目标个体，不但依赖育种家的经验，而且常常 受到基因型和环境互作的影响，很难选择到理想的基因型。分子标记辅助选择是将分子标 记应用于作物品种改良过程中进行选择的一种辅助手段，主要包括对目标性状的前景选择 和对遗传背景的背景选择。在回交转育过程中利用分子标记辅助背景选择，可W显著加快 背景回复的速度，缩短育种时间。
[0003] 适用于背景选择的分子标记需要满足3个基本条件：简单、快捷和低成本。SSR和 SNP是目前在玉米遗传育种中应用最为广泛的两种分子标记，二者各有优缺点。WPCR为基 础的SS財示记具有多态性高、操作简单、重复性好等优点，但是难W实现位点的高通量。W序 列为基础的SNP标记分布密度高、遗传稳定性好、易于实现高通量、自动化分析，但是检测成 本相对较高。本发明分别利用SSR和SNP标记对玉米回交转育群体材料进行遗传背景分析， 比较两种标记在分子标记辅助背景选择上的应用效果，为今后开展相关工作提供有益参 考。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供SSR与SNP两种分子标记配合使用进行玉米辅助高效育种的 方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的SSR与SNP两种分子标记配合使用进行玉米辅助高 效育种的方法，其是W玉米自交系京SD127为供体亲本，京SD121为轮回亲本，通过回交转育 获得BCiFi代群体，利用6个SSR标记和104个SNP标记对BCiFi代群体进行背景选择，筛选背景 回复率高的单株。
[0006] 其中，6个SSR标记的信息W及104个SNP标记的信息分别见表1和表2。
[0007] 表1 6个SSR标记的信息
[0009] 表2 104个SNP标记的信息
[0020] 其中，N为A、T、G或 C。
[0021] 具体包括如下步骤：
[0022] 1)提取待测植株的基因组DNA;
[0023] 2似待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增所述SS財示记的引物，进行PCR扩增反 应；
[0024] 3)检测PCR扩增产物。
[0025] 优选地，步骤1)中采用CTAB法提取玉米的基因组DNA，待发苗后，取3~即十期的叶 片用于DNA提取。
[0026] PCR反应体系如下：DNA模板4i^l，10mMdNTPl.化l，含2.5mMMgCl2的10X反应缓 冲液化1，正、反向引物各0.12扣1，抓AU化q DNA聚合酶0.化1，dd也0补足至;反应程 序如下：94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸453,35个循环；72°(：延伸 IOmin; 4 °C 保存。
[0027] 更优选地，步骤3)中用毛细管电泳检测SSR标记的PCR扩增产物。
[0028] 本发明利用忍片技术对所述SNP标记进行检测。
[00巧]本发明利用SSR和SNP两种标记对京SD127/京SD121/京SD121的BCiFi代群体进行分 子标记辅助背景选择，W加快玉米自交系京SD121的改良速度。经筛选，在回交亲本间具有 多态性的引物有6对。利用多态性引物对BCi代群体进行毛细管电泳检测，结果表明，157个 单株轮回亲本背景回复率在50-100%之间，背景回复率为100%的单株有1株，91.67%的单 株有14株。利用MaizeSNP3072忍片分析后发现，104个多态性SNP位点可W将157株个体进行 精细排序，背景回复率介于51.92-93.75%之间。比较SSR和SNP标记的背景选择结果，两种 标记呈中等程度相关。因此，可W在回交早代将SSR和SNP标记结合使用进行背景选择，从而 实现大群体严选择，提高选择效率。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明实施例1中基于SSR标记的BCiFi代单株背景回复率分布图。
[0031] 图2为本发明实施例1中基于SNP标记的BCiFi代单株背景回复率分布图。
【具体实施方式】
[0032] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a Iaboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0033] 实施例1 SSR与SNP两种分子标记配合使用进行玉米辅助高效育种的方法
[0034] I材料与方法
[0035] 1.1供试材料
[0036] 玉米自交系京SD121配合力高、综合性状优良，但存在穗位偏高、抗倒性稍差的缺 点。W低穗位且抗倒性好，与京SD121亲缘关系较近的自交系京SD127做为供体亲本，W京 SD121为轮回亲本，通过回交转育改良京SD121的抗倒性。本实施例选用经田间表型选择初 步入选的157株BCiFi代回交群体为研究材料。
[0037] 1.2 DNA提取
[003引京SD127与京SD121室内沙培发苗，3~即十期提取DNAdBCiFi代田间单株挂牌标记取 样。采用CTAB法提取基因组DNA，去除RNA。琼脂糖电泳检测DNA的完整性，利用化no化OP 2000微量紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度。
[0039] 1.3 SSR标记
[0040] 1.3.1 引物
[0041] 利用40对多态性高、在染色体上均匀分布的SSR核屯、引物进行分子标记辅助背景 选择，引物信息见 Wang 等（Wang F,Tian H,Zhao J,et al.Development and characterization of a core set of SSR markers for fingerprinting analysis of Chinese maize varieties[J].Maydica,2011,56(1):1-11.)。
[0042] 1.3.2 PCR扩增
[0043] PCR反应体系如下:DNA模板化I，IOmM dNTP I.化I，含2.5mM MgCb的10 X反应缓 冲液化1，正、反向引物各0.12扣1，抓AU化q DNA聚合酶0.化1，dd此0补足至;反应程 序如下：94°C预变性5min;94°C变性40s，60°C退火35s，72°C延伸453,35个循环；72°(：延伸 IOmin;4°C保存。PCR扩增在Veriti 384Well Thermal Cycler仪上完成。
[0044] 1.3.3扩增产物检测
[0045] 根据引物巧光颜色差异和扩增产物片段大小，利用AB 3730XL DNA分析仪对PCR产 物进行毛细管巧光多重电泳。96孔电泳板每孔分别加入化L扩增产物的混合物、7.9化L甲酯 胺和0.0祉L GS3730-500分子量内标(A卵lied 81〇373161113，1]54)。95°(：变性5111111，4°(：冷却 IOmin，2500rpm离屯、Imin后，于DNA分析仪上进行电泳。用Date Collection vl. 0软件收集 原始数据。
[0046] 利用Genemarker软件对收集的原始数据进行分析，统计每个单株的基因型。
[0047] 1.4 SNP标记 [004引1.4.1位点信息
[0049] 利用北京市农林科学研究玉米研究中屯、提供的MaizeSNP3072忍片对供试材料DNA 进行SNP基因分型。该忍片包含3072个均匀分布于玉米全基因组的SNP位点，位点信息详见 http: //ww. i 1 Iumina. com. cn和http: //ww. panzea. org网站。本实施例中选用的 1202个 SNP位点是根据分型效果、数据缺失率等从上述3072个位点中优选出来的。
[0化0] 1.4.2忍片检测
[0化1 ] 基于I Ilumina公司的GoldenGate技术平台对MaizeSNP3072忍片进行检测。实验操 作流程如下:待提取的基因组DNA与激活的生物素充分结合后，通过离屯、沉淀使DNA纯化;将 探针与纯化的目的DNA链杂交，漂洗杂交产物除去非特异结合试剂或过量试剂后进行延伸 连接反应;延伸后产物经漂洗变性后作为模板进行PCR扩增，PCR产物与磁珠结合后过滤纯 化;将纯化的PCR产物与忍片杂交，杂交结束后进行忍片清洗、真空抽干;风干后的忍片立刻 在iScan仪上进行扫描，最后利用GenomeS化dio软件进行数据分析。
[0052] 详细实验流程参照GoldenGate吸;Genetyping Assay实验操作指南。
[0化3] 1.5轮回亲本背景回复率（p;ropo;rtion of recurrent parent genome,PRPG)的计 算
[0054] 计算公式:PRPG=[ 1-(差异等位基因数/(2X有效位点数））]X 100%
[0055] 其中，差异等位基因数是指BCi单株与京SD121表现不一致的等位基因数目，有效 位点数是指在双亲中存在多态性的位点总数。
[0056] 2结果与分析
[0化7] 2.1 SSR标记辅助背景选择
[0化引 2.1.1多态性引物筛选
[0059] 利用40对SSR核屯、引物对京SD127和京SD121的DNA样品进行扩增，经巧光毛细管电 泳检测从中筛选到了 6对在二者之间表现多态性的SSR引物(表1)。
[0060] 表1 6个SSR标记的信息
[0062] 2.1.2 BCi代分子标记辅助背景选择
[0063] 从种植的京SD127/京SD121/7京SD121 BCi代群体中选择穗位较低、植株性状与京 SDm接近的157个BCi代单株挂牌标记、提取叶片DNA。利用在回交亲本间具有多态性的6对 背景选择引物对BCi代单株进行毛细管电泳检测，统计扩增谱带与轮回亲本京SD121存在差 异的等位基因数目，计算BCi代各单株轮回亲本背景回复率。结果表明，157个单株背景回复 率集中在50%、58.33%、66.67%、75%、83.33%、91.67%、100%运7个数值上，背景回复率 为66.67 %的单株数量最多，为45株;背景回复率为100 %的单株数量最少，仅有1株（图1)。 背景回复率含91.67%的15个单株见表3。
[0064] 表3背景回复率>91.67%的BCi代单株(基于SSR标记）
[0066] 2.2 SNP标记辅助背景选择
[0067] 利用MaizeSNP3072忍片对157株BCi代单株及双亲进行SNP基因分型，发现在1202 个分析位点中有104个SNP位点在双亲间存在多态性（表2)。统计分型结果与轮回亲本京 SD121存在差异的等位基因数目，计算BCi代各单株的轮回亲本背景回复率。结果表明，157 个单株的背景回复率在51.92-93.75%之间，其中具有相同回复率的单株数最多不超过5 个，即利用1202个SNP位点可W将157个单株轮回亲本背景回复率进行更加精细的排序。图2 显示了BCiFi代单株背景回复率从高到低的分布情况，回复率>86.54%的15个单株见表4。 [00 6引 表2 104个SNP标记的信息
[00巧]其中，N为A、T