蛋白水平检测目 标基因的表达。
[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明首次提供利用SPL18基因 促进穗分支，提高单穗粒数或/和粒重，提高产量的方法，通过在作物中过表达SPL基因，能 有效促进穗分支，提高单穗粒数或/和粒重3 %以上，增产5%以上。该技术能有效提高单株 产量和单位面积产量，增加粮食生产，为国家粮食安全提供新思路。 (四）
【附图说明】
[0032] 图 1:水稻 SPL18 基因 0sSPL18 过表达载体 pCambial300-p0sSPL18-0sSPL18-p35S-pZmUb i_1174(geno)的 T-DNA结构示意图。
[0033] 图2:水稻 SPL18 基因 cDNA 过表达载体 pCambial300-pZmUbi-1174-p35S-0sSPL18-ter的T-DNA结构示意图。
[0034] 图3:水稻SPL18基因 cDNA过表达载体pCambial300-p0sSPL18-0sSPL18-p35S-pZmUbi-1174；
[0035] PCambial300-p0sGA20oxl-0sSPL18-p35S-pZmUbi-1174；
[0036] pCambial300-p0sTEL-0sSPL18-p35S-pZmUbi-1174；pCambial300-p0sARG0S-0sSPL18-p35S-pZmUbi-1174 的 T-DNA 结构示意图。 (五)
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0038] 本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在 Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology，和 J.Sambrook 等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的 Molecular Cloning:A Labortory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。
[0039] 实施例1水稻SPL18基因0sSPL18过表达载体的构建
[0040] 0sSPL18基因表达框基因组序列（核苷酸序列为SEQIDN0.5所示）的获得：设计 PCR引物：
[0041 ] 0 s SPL18-geno-F(5，TGGTACCGATCTCACGTAAATACAATTCTCC)和0s SPL18-geno-R(5 ' CGGGTACCAATGATATATTTCTGCATAAGTTT)，以商业水稻品种秀水-134基因组为模板，通过PCR 扩增获得推测的包括0sSPL18基因启动子、表达序列和终止子序列的大小为7.4kb的基因组 片段，序列如SEQ ID如:5所示。？0?反应条件为:951€3分钟;95°(：15秒，58°(：15秒，72 1€7.5 分钟，重复33个循环;然后72 °C 10分钟。
[0042]农杆菌 T-DNA 载体的构建：双元载体 pCambial300-p35S-G10 载体（Internationl Pat .No .PCT/CN2012/087069: SEQ ID Ν0· 47)包含一个耐草甘膦基因（EPSPS)(作为转化的 标记基因）和P35S启动子(作为目标基因的增强子）。经过ΚρηΙ酶切以后，去磷酸化，作为克 隆的载体与经过同样酶切的大小为7.4kb的OsSPL18基因组片段连接。获得的T-DNA结构为： "启动子-OsSPLIS基因-终止子-增强子-启动子-耐草甘膦基因-终止子"。这个载体命名为： pCambial300-0sSPL18-p35S-pZmUbi-1174(geno)图 1)。最后，通过电转的方法把这个 T-DNA 质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含有15μg/ml四环素和50yg/mL的卡那霉素的YEP固体培养 基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接下来的植物转化。
[0043] 实施例2水稻SPL18基因 cDNA过表达载体的构建
[0044] l、cDNA 的克隆
[0045] 水稻〇sSPL18 基因 cDNA 的克隆：设计PCR 引物 0sSPL18-CF(5' GGATCCAACAATGGATTGGGATCTCAAGATG)和OsSPLlS-CRCS' GAGCTCCTACTGCCACGAGAATGGGAGCG)，以自交系9311的总RNA反转录成的cDNA为模板，通过 PCR扩增获得0sSPL18的cDNA序列。PCR反应条件为:95°C3分钟；95°C 15秒，58°C 15秒，72°C90 秒，重复33个循环;然后72°C 10分钟。将获得的大约1.5kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。 然后，通过BamHI和SacI双酶切得到相应的cDNA(SEQ ID N0:6)，并且DNA序列测定表明cDNA 的核苷酸序列正确。然后以pCambial300为过渡载体，用BamHI和SacI双酶切获得测序正确 的0sSPL18 cDNA片段，用SacI和ΚρηΙ双酶切获得人工合成的终止子片段，然后再把上述两 个片段和用BamHI和ΚρηΙ双酶切后的pCambial300载体连接，获得的包含0sSPL18 cDNA和人 工合成终止子(SEQ ID勵:9)的过渡载体，命名为?〇31111^3130〇-〇83?1^1846匕保菌，用于构 建转化植物的终载体。
[0046] 2、启动子的克隆
[0047] 2.1组成型启动子的获得及其调控0sSPL18基因表达的载体构建
[0048]启动子的获得
[0049] 花椰菜花叶病毒35S启动子为人工合成序列p35S(SEQIDN0:ll)，两端分别连接 有Hindlll和BamM酶切位点。
[0050] 载体构建
[0051 ] 农杆菌T-DNA载体的构建：双元载体pCamb ial 300-G10载体（Internationl Pat .No .PCT/CN2012/087069: SEQ ID NO. 49)包含一个耐草甘膦基因（EPSPS)(作为转化的 标记基因）。用BamHI和ΚρηΙ对之前构建好的pCambial300-0sSPL18-ter进行双酶切，回收获 得0sSPL18-ter片段；用Hindlll和BamHI酶切含有p35S的质粒，获得p35S片段；用Hindlll和 Κρη I对pCamb i a 1300-G10载体进行双酶切，回收得到酶切后的载体。然后，把上述酶切后的 载体和两个片段进行三段连接，获得终载体。获得的T-DNA结构为："启动子-0sSPL18基因-终止子-启动子-耐草甘膦基因-终止子"。这个载体命名为:pCambial300-p35S-0sSPL18-pZmUbi-1174(图2)。最后，通过电转的方法把这个T-DNA质粒转入农杆菌LBA4404中，通过含 有15μg/ml四环素和50yg/mL的卡那霉素的YEP固体培养基筛选出阳性克隆，并保菌，用于接 下来的植物转化。
[0052] 2.2组织特异性启动子的克隆
[0053]水稻SPL18基因0sSPL18启动子(p0sSPL18)的克隆：设计PCR引物p 0sSPL18-F(5' GGTACCGATCTCACGTAAATACAATTCTC)和p 0sSPL18-R(5'GGATCCGGCTCCACTCCACGCCACTT)，以 商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得0sSPL18的5'端的序列。PCR反应条 件为:95°C 3分钟;95 °C 15秒，58 °C 15秒，72°C 2分钟，重复30个循环;然后72°C 10分钟。将获得 的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD 19中。然后，通过ΚρηΙ和BamHI双酶切得到相应的启 动子pOsSPL18,并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列正确(SEQ ID N0:12)。
[0054] 水稻GA20oxl基因0sGA20oxl启动子（p0sGA20oxl)的克隆：设计PCR引物 p0sGA20oxl-F(5 ' CAAGCTTCTCTCTTCTATGCCACCAGTTC)和p0sGA20oxl-R(5 ' TGGATCCTGTTGATAATCTAGCTATCAATCAATTA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过 PCR扩增获得0sGA20oxl的5 '端的序列。PCR反应条件为:95 °C 3分钟;95°C 15秒，58°C 15秒，72 °C2分钟，重复30个循环;然后72°C10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19 中。然后，通过Hindlll和BamHI双酶切得到相应的启动子p0sGA20oxl，并且DNA序列测定表 明启动子的核苷酸序列正确（中国专利201510612568.3:SEQ ID N0:2)。
[0055] 水稻（Oryza sativa)Mei2_like基因启动（pOsTEL)子的克隆：设计PCR引物 p0sTEL-F(5 'AAGCTTGAAACTAGTACTAGACATTACTCTTCCAATGCA)和p0sTEL-R(5 ' AGAGGATCCTGCAGCAGCACTTACCTACCCTACCA)，以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过 PCR扩增获得pOsTEL。PCR反应条件为:95 °C 3分钟；95 °C 15秒，58 °C 15秒，72 °C 2分钟，重复30 个循环;然后72°C10分钟。将获得的大约2kb的PCR产物克隆到T-载体pMD19中。进一步使用 引 物0sTE-PR0-DELF(5 'AGATCCGAGCAAA AAACAGGGCC)和0sTE_PR〇-DELR(5 ' TCTATAGCGATAGAACTGTTTGATCTGGGT AGC)进行点突变，去除启动子内部BamHI位点。最后，通 过Hindlll和BamHI双酶切得到相应的启动子，并且DNA序列测定表明启动子的核苷酸序列 正确（Internationl Pat.No.PCT/CN2012/087069:SEQ ID N0:52)〇
[0056] 水稻ARGOS基因 OsARGOS启动子(pOsARGOS)的克隆：设计PCR 引物pOsARGOS-F (5 ' CAAGCTTCGGCAGCAACGGACTGAGAG)和p0sARG0S-R(5 ' TGGATCCAGCGAGCTTGAGCTAGCTTAGCTC)， 以商业水稻品种秀水134基因组为模板，通过PCR扩增获得OsARGOS的5 '端的序列。PCR反应 条件为:95 °C 3分钟;95 °C 15秒，58 °C 15秒，72 °C 2分钟，重复30