清1640细胞培养基将细胞吹洗下来，转 移入50mL培养基中，并用无血清1640细胞培养基洗涂两次后细胞计数。
[0066] 2.3.4细胞融合
[0067] 将SP2/0细胞与脾细胞按1:10的比例加入到50血离屯、管中，混合均匀后lOOOr/min 离屯、lOmin，弃去上清，轻轻拍打离屯、管底部，使细胞沉淀松动，并于Imin之内滴加 lmL37°C 水浴中预热的50%PEG(边滴加边轻轻振荡W混匀），将离屯、管静置于37°C、5%C02培养箱 中，IOmin后滴加无血清1640细胞培养液W终止融合，具体操作如下：第一分钟匀速滴加 ImL，第二分钟匀速滴加2mL，第S分钟匀速滴加3mL，第四分钟匀速滴加4mL，第五分钟匀速 滴加5mL，滴加时轻轻振摇混匀，之后缓慢添加无血清1640细胞培养液至40mL，80化/min离 屯、lOmin，弃上清，并缓慢加入适量含20%FBS的HAT完全培养液并轻柔摇匀。将融合后的细 胞加入到提前铺好饲养细胞的96孔板中，100化/孔。一个免疫脾脏可铺制4块96孔细胞板。 铺好的细胞板于37°C、5%C02及饱和湿度的培养箱内培养。融合后的细胞在第3、6天用含 20%FBS的HAT完全培养液半量换液。至第9、12天用含20%FBS的HT完全培养液半量换液培 养。
[006引 2.4抗体的检测
[0069] 当杂交瘤细胞覆盖孔底10 %~20 %的面积时，吸取培养上清，采用间接化ISA方法 进行抗体效价的检测，W筛选分泌抗牛支原体的杂交瘤细胞。具体操作如下：
[0070] 2.4.1用包被液（包被液为0.05M，p朋.6的碳酸盐缓冲液：Na2C〇3 0.159g，化H(X)3 0.293g，此0 1000血)将步骤2.1.4中得到的纯化的牛支原体全菌蛋白稀释至50yg/mL，每孔 加10化L，37°C解育化后再4°C过夜；
[0071] 2.4.2倾去包被液并拍干残留液体，用SOOiil洗涂液(0.01M，pH7.4的PBST :K此P〇4 0.2g，Na抽P04l.l5g，NaC18.0g，KC10.2g，Tween-20 0.5mL，加蒸馈水至1000ml)洗涂3次；
[0072] 2.4.3每个孔中力日300山封闭液巧％脱脂乳），37°C解育化，倾去封闭液并拍干残留 液体，用30化1洗涂液洗涂3次；
[0073] 2.4.4加入1:100PBST稀释的待检细胞上清，100山/孔，37°C解育比，倾去上清并拍 干残留液体，用30化1洗涂液洗涂3次；同时做空白、阴性及阳性孔对照于反应孔中；
[0074] 2.4.5每孔加入1:8000?85巧希释的酶册?标记的羊抗兔二抗，10041/孔，37°(：解育 化，倾去上清并拍干残留液体，用30化1洗涂液洗涂3次；
[00巧]2.4.6显色:每孔中加入TMB底物溶液，IOOiil/孔，37 r解育10~30分钟；
[0076] 2.4.7终止反应:每孔中加入SOiil 2M的硫酸溶液终止反应；
[0077] 2.4.8结果判定:应用酶标仪测定450皿的吸光值，P/N值大于2. IW上者，即为阳性 克隆。
[007引 2.5阳性杂交瘤细胞的克隆
[0079] 依据抗体检测的结果选择高水平抗体的培养孔，并对其中的细胞进行亚克隆。亚 克隆操作采用有限稀释法，具体操作步骤如下：
[0080] 2.5.1用2(K)化移液器将要克隆的阳性孔中的培养液吸出，加入2(K)化新的HT培养 液，反复吹打将细胞悬起，并计数细胞；
[0081] 2.5.2调整细胞数为3~10个/mL,取铺制好饲养细胞的细胞培养板，每孔加入稀释 细胞10化L，置于37 °C、5 % C02及饱和湿度的培养箱内培养；
[0082] 2.5.3 6天左右会看到一些孔中长出微小的细胞集落，第7天换液，此后每2~3天 换一次培养液，至9天左右时可看到细胞克隆的形成；
[0083] 2.5.4对有细胞克隆的孔及时进行抗体检测，阳性孔的细胞再进行第二次亚克隆， 方法同第一次亚克隆；
[0084] 2.5.5连续；次亚克隆，得到100 %表达牛支原体抗体的阳性杂交瘤细胞株时才完 成杂交瘤细胞的建株过程。
[0085] 2.5.6选择细胞生长良好，强阳性的单克隆生长孔，转移细胞到24孔板并进一步扩 大培养。
[00化]2.6杂交瘤细胞的保藏
[0087] 将经化ISA检测呈阳性反应并可W稳定传代和分泌预期抗体的杂交瘤细胞株进行 保藏，细胞分类命名：杂交瘤细胞株NZYT-ZJC，保藏单位：中国典型培养物保藏中屯、，保藏地 址:湖北省武汉市武汉大学，保藏日期:2015年11月8日，保藏编号:CCTCC C2015183。
[0088] 2.7杂交瘤细胞的冻存与复苏
[0089] 2.7.1用培养液将细胞瓶内扩大培养的细胞吹打下来，悬浮均匀，转移至15mL离屯、 管中，SOOr/min 离屯、IOmin;
[0090] 2.7.2弃上清，用细胞冻存液(20%FBS，10%DMS0,70%的RPMI-1640培养液)悬浮 细胞；
[0091] 2.7.3准备若干个2mL细胞冻存管，每管分装ImL细胞悬液，4°C放置30min后-20°c 放置化，之后转入-80°C过夜，次日放入液氮罐内保存；
[0092] 2.7.4复苏时迅速从液氮罐中取出，放入37°(：水浴锅中迅速解冻，100化/111111离屯、 5min，弃去上清液，用培养液将细胞重新悬浮并洗涂两次；
[0093] 2.7.5将细胞转移至前一天已铺好饲养细胞的培养瓶中，37°C、5%C〇2及饱和湿度 的培养箱内培养，当细胞形成集落时2.4中的方法检测抗体活性。
[0094] 2.8杂交瘤细胞株的效价及稳定性测试
[00M] 2.8.1将杂交瘤细胞株在RPMI-1640培养基中培养传代，每3~5天传代一次，传代 到5代后应用2.4所述间接化ISA方法进行单抗效价测定，细胞培养液上清中单抗效价至少 为 1:100。
[0096] 2.8.2将杂交瘤细胞株在RPMI-1640培养基中继续进行培养、传代，培养到8代后， 杂交瘤细胞株仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可W达到1: IOOW上。
[0097] W上结果表明，所得杂交瘤细胞株能够稳定传代，可W持续、稳定分泌抗牛支原体 的单克隆抗体。
[0098] 2.9牛支原体特异性单克隆抗体的制备
[0099] 2.9.1取8周龄的BALB/C小鼠，腹腔注射0.5mL的液体石蜡；
[0100] 2.9.2注射石蜡9d后，将细胞瓶中生长良好的杂交瘤细胞悬浮，转移至离屯、管内 100化/min离屯、IOmin，将细胞重悬于培养液中，吸取少量计数，并将细胞稀释至3-5 X IO^ mL，每只小鼠腹腔注射SXlO5-IO6个杂交瘤细胞，10d后可产生腹水，待小鼠腹部明显膨大时 收集腹水；
[0101] 2.9.3用酒精棉擦拭小鼠腹部进行消毒，用灭菌针头刺入腹腔，避免碰到脏器引起 死亡，将腹水导入灭菌EP管内，每只小鼠大约可收集腹水S-10mL
[0102] 2.9.4 4°C，1200r/min离屯、3min，收集中间层，ELISA测定抗体效价，分装后-20°c 保存备用，同时冻存细胞。
[0103] 2.10单抗的纯化
[0104] 采用辛酸-硫酸锭-蛋白A亲和层析法纯化小鼠腹水中的IgG,其基本步骤如下：
[0105] 1)腹水用1200化pm离屯、lOmin，并经0.22皿滤器过滤，W除去脂质等杂质；
[0106] 2)用4倍体积的醋酸钢缓冲液(60mmol/L，抑值4.0)稀释腹水，并用O.lmol/L的氨 氧化钢溶液调pH值至4.5;
[0107] 3)在冰浴条件下，将辛酸(按25化辛酸/mL原腹水计算)逐滴加入样品中，边滴加边 揽拌，滴加完后继续揽拌30min;
[0108] 4)5 OOOg离屯、30min，取上清液按体积比10:1与10倍PBS混合，用O.lmmol/L的氨氧 化钢溶液调抑值至7.4;
[0109] 5)加入硫酸锭(每毫升混合液0.227g)，揽拌30min后，10 OOOg离屯、15min，弃上清 液，将沉淀悬浮于P