一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方法
【专利摘要】本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种提高草分枝杆菌发酵生物量的培养基原料及其应用。通过纤维素酶酶解处理、烘干、粉碎或通过枯草芽孢杆菌发酵处理、灭菌、烘干、粉碎的人参药渣细粉，作为培养基原料用于草分枝杆菌发酵，可以显著提高发酵生物量，为草分枝杆菌的工业化生产及开发应用提供了很实用的方案；同时，也为中药渣的利用提供一种有效途径。CGMCC NO. 091620030401
【专利说明】_种培养获得局生物量的草分枝杆菌的方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及微生物发酵领域，特别是一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方 法。
【背景技术】
[0003] 随着中药行业不断发展，在中成药生产等过程中产生的药渣废弃量也日益增加。 目前我国有近1500家中药企业，每年排放中药渣约1300万t。这些药渣常常由于处理不当， 造成了严重的环境污染和资源浪费。一些含人参的中成药生产时，人参主要提取人参皂苷 类活性成分，剩余人参药渣中仍含有大量多糖，是一种很好的微生物发酵原料。
[0004]草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)是抗酸分枝杆菌属内广泛分布于自然界的一 种对人与动物无致病性、快生长的腐生菌，是一种宝贵的天然药物资源。草分枝杆菌在1889 年被发现，与结核杆菌具有生物亲缘性，广泛存在于土壤、植物和饮水中。目前，草分枝杆菌 被广泛作为人和动物多功能免疫增强剂使用，其主要成分为胞壁酰二肽(MDP)、分枝杆菌多 糖(MPS)、CpG免疫调节序列等。
[0005]目前，对草分枝杆菌的研究主要集中在制剂研究、应用方法及效果研究等。但在生 产过程中获得更多生物量的草分枝杆菌同样具有重要意义。本申请要解决的技术问题即在 现有技术的基础上，通过在培养基中添加人参药渣细粉来获得更多生物量的草分枝杆菌， 草分枝杆菌的工业化生产及开发应用提供了很实用的方案；同时，也为中药渣的利用提供 一种有效途径。
[0000]公告号为CN102206590A的发明专利" 一种草分枝杆菌Sq-Ι及复合微生态制剂的制 备方法"（申请号：CN201010572928.9)对该草分枝杆菌Sq-Ι及复合微生态制剂的制备方法 进行了公布。所述的草分枝杆菌Sq_l(Mycobacterium plei Sq-Ι)，保藏号:CGMCC N00916 和枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)保藏号:ACCC10634。
[0007] 生物材料样品的保藏信息为:草分枝杆菌Mycobacterium phlei，Sq_l保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，保藏日期：2003年4月1日，保藏编号:CGMCC N0.0916。枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，购于2013年10月12日， 保藏号:ACCC10634。
[0008] 该制备方法发酵生物量有限，亟待改进。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方法。
[0010] 本发明的目的是通过如下途径实现的：一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方 法，其步骤如下： A. 种子活化，种子培养基的成分:纯水中含蔗糖20-25g/L，蛋白胨2.5-3g/L，柠檬酸钠 20-25g/L，磷酸二氢钾 1 · 0-1 · 5g/L，磷酸氢二钠 1 · 5-2 · Og/L，琼脂 15-20g/L，pH7 · 0-7 · 2g/L; 接种，30 ± 1°C培养48小时，镜检无杂菌且生长健壮； B. 种子罐发酵，培养基成分为:纯水中含人参药渣20-60g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，柠檬 酸钠15-22g/L，磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠1.5-2. Og/L，PH6.5-7.2;接种，自动添 加消泡剂，通气量1: 〇. 6-0.8，30 ± 1°C培养28-32小时，镜检无杂菌且生长健壮； C. 发酵罐发酵，培养基成分为：纯水中含人参药渣20-60g/L，蛋白胨1.5-2. Og/L，柠檬 酸钠15-20g/L，磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠1.5-2. Og/L，PH6.5-7.2;接种，自动添 加消泡剂，通气量1: 〇. 8，30 ± 1°C培养46-54小时，菌数达101()个/mL停止发酵，得到草分枝 杆菌体。
[0011] 作为本方案的进一步优化，所述的人参药渣细粉优选添加量为每升纯水中含人参 药渣40g/L。
[0012] 作为本方案的进一步优化，所述的人参药渣细粉通过纤维素酶酶解处理或通过枯 草芽孢杆菌发酵处理。
[0013] 作为本方案的进一步优化，所述的人参药渣细粉细粉细度为80-200目。
[0014] 本发明一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方法，通过在发酵培养基中加入含 人参药渣细粉，获得了可以显著提高发酵生物量的草分枝杆菌发酵培养基及发酵方法，为 草分枝杆菌的工业化生产及开发应用提供了很实用的方案；同时，也为中药渣的利用提供 一种有效途径。
【具体实施方式】
[0015] 本发明一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方法，其步骤如下： A. 种子活化，种子培养基的成分:纯水中含蔗糖20-25g/L，蛋白胨2.5-3g/L，柠檬酸钠 20-25g/L，磷酸二氢钾 1 · 0-1 · 5g/L，磷酸氢二钠 1 · 5-2 · Og/L，琼脂 15-20g/L，pH7 · 0-7 · 2;接 种，30 ± 1°C培养48小时，镜检无杂菌且生长健壮； B. 种子罐发酵，培养基成分为:纯水中含人参药渣20-60g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，柠檬 酸钠15-22g/L，磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠1.5-2.0g/L，PH6.5-7.2;接种，自动添 加消泡剂，通气量1: 〇. 6-0.8，30 ± 1°C培养28-32小时，镜检无杂菌且生长健壮； C. 发酵罐发酵，培养基成分为：纯水中含人参药渣20-60g/L，蛋白胨1.5-2.0g/L，柠檬 酸钠15-20g/L，磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠1.5-2.0g/L，PH6.5-7.2;接种，自动添 加消泡剂，通气量1: 〇. 8，30 ± 1°C培养46-54小时，菌数达101()个/mL停止发酵，得到草分枝 杆菌体。
[0016] 所述的人参药渣细粉优选添加量为纯水中含人参药渣40g/L，人参药渣细粉通过 纤维素酶酶解处理或通过枯草芽孢杆菌发酵处理，人参药渣细粉细粉细度为80-200目。
[0017] 以下实施例采用草分枝杆菌sq-ι(保藏号:CGMCC N0.0916)进行具体标书，也可采 用市场上可以购买得到的草分枝杆菌菌株。
[0018] -、用制备参麦注射液的药渣来制取人参药渣粉，再用作培养基原料，进行草分枝 杆菌发酵。
[0019] 实验例一取参麦注射液生产中的人参药渣，加纤维素酶，酶解，烘干，粉碎得细度 80-200目的细粉。按4%添加量加入到草分枝杆菌发酵培养基中，进行发酵，结果计数。
[0020]实验例二取参麦注射液生产中的人参药渣，加枯草芽孢杆菌，发酵，灭菌，烘干， 粉碎得细度80-200目的细粉。按4%添加量加入到草分枝杆菌发酵培养基中，进行发酵，结果 计数。
[0021 ]二、用制备参芪口服液的药渣来制取人参药渣粉，作培养基原料，进行草分枝杆菌 发酵。
[0022] 实验例三取芪参口服液生产中的人参药渣，加纤维素酶，酶解，烘干，粉碎得细度 80-200目的细粉。按4%添加量加入到草分枝杆菌发酵培养基中，进行发酵，结果计数。
[0023] 实验例四取芪参口服液生产中的人参药渣，加枯草芽孢杆菌，发酵，灭菌，烘干， 粉碎得细度80-200目的细粉。按4%添加量加入到草分枝杆菌发酵培养基中，进行发酵，结果 计数。
[0024] 三、对照方法按公告号为CN102206590A的发明专利"一种草分枝杆菌Sq-Ι及复 合微生态制剂的制备方法"（申请号：CN201010572928.9)中所述草分枝杆菌发酵方法进行 发酵，结果计数。
[0025] 注:参麦注射液由红参、麦冬提取而成，红参:麦冬的比例为1:1。
[0026] 芪参□服液由黄芪、人参、甘草提取制成，黄苗:人参:甘草的比例为3:2:2。
[0027]四、结果对比
通过上表可知，通过添加由纤维素酶酶解处理或枯草芽孢杆菌发酵处理的人参药渣粉 的培养基进行草分支杆菌发酵，与现有技术方法相比，其发酵生物量分别提高了 7.22倍、 5.28 倍、10.28 倍、6.11 倍。
【主权项】
1. 一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方法，其特征在于:其步骤如下： A. 种子活化，种子培养基的成分:纯水中含蔗糖20-25g/L，蛋白胨2.5-3g/L，柠檬酸钠 20-25g/L，磷酸二氢钾 1 · 0-1 · 5g/L，磷酸氢二钠 1 · 5-2 · Og/L，琼脂 15-20g/L，pH7 · 0-7 · 2;接 种，30 ± 1°C培养48小时，镜检无杂菌且生长健壮； B. 种子罐发酵，培养基成分为:纯水中含人参药渣20-60g/L，蛋白胨2.0-2.5g/L，柠檬 酸钠15-22g/L，磷酸二氢钾1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠1.5-2. Og/L，PH6.5-7.2;接种，自动添 加消泡剂，通气量1: 〇. 6-0.8，30 ± 1°C培养28-32小时，镜检无杂菌且生长健壮； C. 发酵罐发酵，培养基成分为：纯水中含人参药渣20-60g/L，蛋白胨1.5-2. Og/L，黄芪 浸膏 15g/L，柠檬酸钠 15-20g/L，磷酸二氢钾 1.0-1.5g/L，磷酸氢二钠 1.5-2. Og/L，PH6.5-7.2;接种，自动添加消泡剂，通气量1: 0.8，30 ± 1°C培养46-54小时，菌数达101Q个/mL停止 发酵，得到草分枝杆菌体。2. 如权利要求1所述的一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方法，其特征在于:所述 的人参药渣细粉优选添加量为纯水中含人参药渣40g/L。3. 如权利要求1所述的一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方法，其特征在于:所述 的人参药渣细粉通过纤维素酶酶解处理或通过枯草芽孢杆菌发酵处理。4. 如权利要求1所述的一种培养获得高生物量的草分枝杆菌的方法，其特征在于:所述 的人参药渣细粉细粉细度为80-200目。
【文档编号】C12N1/20GK105838637SQ201511013469
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月31日
【发明人】李林, 张素琴, 许加娟, 胡智鹏, 蒋宇, 张世敏, 黎明, 潘沼羽, 粟仁, 荣邵群, 朱瑶, 文少怀, 康汇然, 罗永祥, 康建南
【申请人】湖南圣雅凯生物科技有限公司