一种抗菌肽Enterocin P 及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗菌肽Enterocin P的制备方法及其应用。本发明的抗菌肽Enterocin P基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明的抗菌肽Enterocin P基因编码的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明的抗菌肽Enterocin P的制备方法，包括如下步骤：(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因；(2)构建能高效表达重组质粒；(3)构建乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌；(4)利用基因工程菌表达抗菌肽；(5)对抗菌肽的抑菌活性进行检测。本发明对病原菌具有较强的抑菌活性，安全无毒，无副作用。
【专利说明】
一种抗菌肽Enteroci n P及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽Enterocin P及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，抗生素在动物养殖业中的大量滥用，导致抗生素耐药性菌株不断出现、药 物残留、环境污染和生态破坏等诸多问题，严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。因此，寻 找一种能替代抗生素的新型抗菌制剂迫在眉睫。抗菌肽具有抗菌效果好、热稳定性好、无 毒、无残留、无副作用、安全高效、对环境无污染且不易产生细菌耐药性等优点，有望成为解 决抗生素滥用这一难题的有效方法。
[0003] 抗菌肽是生物防御系统中产生的对抗外源性病原体的肽类物质，是生物天然的、 防御系统的重要组成部分。抗菌肽来源极其广泛，从植物、昆虫、鸟类、哺乳动物、微生物都 已被发现有抗菌肽的产生。迄今为止，已有近千种抗菌肽被相继分离纯化及鉴定。
[0004] 细菌产生的抗菌肽是在其代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性 的多肽类物质。抗菌肽在益生菌中较为普遍。几乎所有的益生菌都能产生一种或几种抗菌 肽物质。近年来，国内外学者已从植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳 球菌等许多益生菌中分离纯化得到多种抗菌肽物质。
[0005] 抗菌肽Enterocin P是从Enterococcus faecium Ρ13分离纯化获得的抗菌肽，命 名为Enterocin P。抗菌肽Enterocin P的结构基因编码71个氨基酸的前肽。其前肽包括27 个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的成熟肽。抗菌肽Enterocin P具有较广的抗菌谱，尤其对 单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有明显的抑制效果，具有较好的应用前 景。
[0006] 抗菌肽Enterocin P在其产生菌Enterococcus faecium P13中含量极低，从产生 菌中提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂且费用昂贵，无法实现大规模生产，从而制约抗 菌肽Enterocin P的实际应用。采用基因工程方法来研究和解决抗菌肽Enterocin P的实际 应用问题可提供一条新的有效技术手段。
[0007] 目前，缺乏一种具有显著的抗病原菌作用的抗菌肽Enterocin P及其制备方法和 应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种具有显著的抗病原菌作用的抗菌肽 Enterocin P及其制备方法和应用。
[0009] 为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案:本发明的一种抗菌肽Enterocin P 基因，具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0010] 本发明所述的抗菌肽Enterocin P基因编码的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0011]本发明所述的抗菌肽Enterocin P的制备方法，包括如下步骤：
[0012] (1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因；
[0013] (2)构建能高效表达抗菌肽Enterocin P的pMG36e_Enterocin P重组质粒；
[0014] (3)用所述pMG36e-Enterocin P重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的基 因工程菌；
[0015] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin P;
[0016] (5)对抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测。
[0017] 进一步地，在步骤（1)中，人工合成两侧含Sac I和Hindm的酶切位点Enterocin P 基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0018] 进一步地，在步骤(2)中，将SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列连接与经限制性内切 酶Sac I和Hindm双酶切后线性化的pMG36e质粒连接获得pMG36e-Enterocin P连接产物， 将连接产物导入大肠杆菌DH5a，获得含pMG36e-Enterocin P重组质粒。
[0019] 更进一步地，在步骤(3)中，所述宿主菌为大肠杆菌DH5a;
[0020] 将提取pMG36e-Enterocin P重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化 转入乳酸乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中进行抗菌肽Enterocin P的诱导表达，电转化处 理参数为2 . OkV、25yF、200 Ω、5ms，经红霉素抗性筛选、PCR验证、酶切鉴定得到正确的含 口]\^366^1^61'〇〇;[11?重组质粒的乳酸乳球菌]\^1363的基因工程菌。
[0021] 进一步地，在步骤(4)中，将含pMG36e-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌MG1363 的基因工程菌接种于含红霉素的GM17培养液中，30°C静置培养过夜;次日以5%接种量转接 至20ml GMl 7培养液中，30 °C继续静置培养时间为5-6h至细菌对数生长期后，将培养液冰浴 10min，4°C5 OOOrpm，离心5min收集培养液上清，将获得的上清液进行0.22μηι过滤获得诱导 后的无菌上清液，得到抗菌肽Enterocin Ρ。
[0022] 进一步地，在步骤(5)中，采用琼脂扩散法对上清液的抑菌活性进行检测，经37°C 培养后，抗菌肽Enterocin P对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌或沙门氏菌的抑菌 活性进行检测。
[0023]本发明所述的抗菌肽Enterocin P动物饲料中的应用。
[0024] 进一步地，所述动物饲料为饲料添加剂。
[0025] 有益效果:本发明对病原菌具有较强的抑菌活性，安全，无毒，无副作用，无抗生素 耐药性，可用作动物饲料添加剂。本发明的所构建的基因工程菌不仅具有乳酸乳球菌本身 的益生作用，还具有抗菌肽Enterocin P明显的抗病原菌作用，可以更好的作为益生型饲料 添加剂安全有效地应用于动物饲料。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0027] (1)本发明首先合成抗菌肽Enterocin P的基因序列，并克隆到乳酸乳球菌表达载 体中，构建得到重组表达载体;将构建的重组表达载体导入大肠杆菌DH5a扩增载体后再采 用电转化法导入乳酸乳球菌中进行抗菌肽Enterocin P的分泌表达，其对李斯特菌和金黄 色葡萄球菌等病原菌均具有较强的抑菌活性。
[0028] (2)本发明的抗菌肽基因为益生菌Enterococcus faecium P13抗菌肽基因 Enterocin P，所编码的抗菌肽Enterocin P是从益生菌Enterococcus faecium P13发酵上 清液中分离得到的。预期用于动物饲料添加剂中对动物会有更好的作用和益生效果， Enterocin P抗菌肽的成熟肽分子量大约为4.5KDa具有显著的抗病原菌作用。
[0029] (3)本发明所表达的抗菌肽Enterocin P来自于Enterococcus faecium P13,对动 物体没有毒性，因此用本发明的基因制备的抗菌肽与传统的抗生素药物相比，将是一种更 为安全的抗病原菌的短肽类物质。
[0030] (4)本发明以常用的益生菌乳酸乳球菌为宿主菌构建的基因工程菌，乳酸乳球菌 本身就是对动物健康有利的益生菌，同时将抗菌肽Enterocin P在乳酸乳球菌中获得了有 效的分泌表达，本发明的所构建的基因工程菌不仅具有乳酸乳球菌本身的益生作用，还具 有抗菌肽Enterocin P明显的抗病原菌作用，可以更好的作为益生型饲料添加剂安全有效 地应用于动物饲料。
【附图说明】
[0031] 图1是本发明的按照质粒提取试剂盒提取由含目的基因的大肠杆菌DH5a质粒的示 意图，泳道1:目的基因质粒；泳道M:500bp ladder marker;
[0032] 图2是本发明的大肠杆菌DH5a目的基因质粒酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳图，泳 道1:目的基因质粒；泳道M:500bp ladder marker;
[0033] 图3是本发明的pMG36e质粒的示意图；
[0034] 图4是本发明采用TaKaRa Biotech限制性内切酶Sac I和Hindm操作说明双酶切 pMG36e质粒的示意图，泳道I :pMG36e质粒;泳道2:pMG36e质粒;泳道M: Ikb ladder marker;
[0035]图5是本发明重组质粒转化大肠杆菌DH5a单菌落的示意图；
[0036]图6是本发明大肠杆菌DH5a单菌落为DNA模板的PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳 图，泳道1:目的基因；泳道2:目的基因；泳道M:250bp ladder marker;
[0037] 图7是本发明天根质粒提取试剂盒操作说明提取大肠杆菌DH5a重组质粒后进行 1 %琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:重组质粒;泳道2:重组质粒;泳道M: Ikb ladder marker;
[0038] 图8是本发明提取大肠杆菌DH5a重组质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切酶Sac I和Hindm操作说明双酶切质粒，产物经1 %琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:重组质粒;泳道Μ: 500bp ladder marker；
[0039] 图9是本发明重组质粒转化乳酸乳球菌MG1363单菌落的示意图；
[0040]图10是本发明乳酸乳球菌MGl 363单菌落为DNA模板的PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶 电泳图，泳道1:目的基因；泳道M:250bp ladder marker;
[0041] 图11是本发明天根质粒提取试剂盒操作说明提取乳酸乳球菌MG1363重组质粒后 进行1 %琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:重组质粒;泳道M: Ikb ladder marker;
[0042] 图12是本发明提取乳酸乳球菌MG1363重组质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切 酶Sac I和Hindm操作说明双酶切质粒，产物经1%琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:目的基因；泳 道2:目的基因；泳道M:250bp ladder marker;
[0043] 图13是本发明Enterocin P对李斯特菌的抑菌效果图，其中1、2、3为实验组；
[0044] 图14是本发明Enterocin P对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图，其中1、2、3为实验 组；
[0045]图15是本发明Enterocin P对沙门氏菌的抑菌效果图，其中1、2、3为实验组。
【具体实施方式】
[0046]以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释 和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
[0047] 本发明的一种抗菌肽Enterocin P基因，具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0048] 本发明所述的抗菌肽Enterocin P基因编码的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0049]本发明所述的抗菌肽Enterocin P的制备方法，包括如下步骤：
[0050] (1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的基因；人工合成两侧含Sac I和 Hindm的酶切位点Enterocin P基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0051 ] (2)构建能高效表达抗菌肽Enterocin P的pMG36e_Enterocin P重组质粒；将SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列连接与经限制性内切酶Sac I和Hindm双酶切后线性化的 pMG36e质粒连接获得pMG36e-Enterocin P连接产物，将连接产物导入大肠杆菌DH5a，获得 含 pMG36e_Enterocin P重组质粒。
[0052] (3)用所述pMG36e-Enterocin P重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的基 因工程菌;所述宿主菌为大肠杆菌DH5a;
[0053] 将提取pMG36e-Enterocin P重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化 转入乳酸乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中进行抗菌肽Enterocin P的诱导表达，电转化处 理参数为2 . OkV、25yF、200 Ω、5ms，经红霉素抗性筛选、PCR验证、酶切鉴定得到正确的含 口]\^366^1^61'〇〇;[11?重组质粒的乳酸乳球菌]\^1363的基因工程菌。
[0054] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin P;将含pMG36e- Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌MG1363的基因工程菌接种于含红霉素的GM17培养液 中，30°C静置培养过夜;次日以5%接种量转接至20ml GM17培养液中，30°C继续静置培养时 间为5-6h至细菌对数生长期后，将培养液冰浴IOmin，4°C5 OOOrpm，离心5min收集培养液上 清，将获得的上清液进行〇.22μηι过滤获得诱导后的无菌上清液，得到抗菌肽Enterocin P。 [0055] (5)对抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测。采用琼脂扩散法对上清液的抑菌 活性进行检测，经37 °C培养后，抗菌肽Enterocin P对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯 特菌或沙门氏菌的抑菌活性进行检测。
[0056]本发明所述的抗菌肽Enterocin P动物饲料中的应用。
[0057]所述动物饲料为饲料添加剂。
[0058] 实施例1
[0059]本发明所使用的主要材料
[0060] 菌株与载体:大肠杆菌MC1061、乳酸乳球菌MG1363和pMG36e质粒菌购于德国Mo Bi Tec公司；DNA Marker购于上海捷瑞有限公司；李斯特菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌为 本实验室所保存;抗菌肽Enterocin P基因由生工生物工程(上海)有限公司合成并转入大 肠杆菌DH5a;引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0061 ]主要试剂与试剂盒:Ml7肉汤培养基购自青岛海博公司；限制性内切酶Sac I和 Hindm、T4 DNA Ligase、EX Taq购自TaKaRa Biotech公司；红霉素、质粒提取和DNA凝胶回 收试剂盒购自天根公司;nis in购于Sigma公司。
[0062]主要试剂的配制：
[0063] GM17:M17肉汤培养基121°C高压灭菌15min，冷却后加入过滤除菌的葡萄糖至终浓 度为〇. 5 % (质量体积比）。
[0064] SGM17:M17肉汤加入终浓度为0.5M蔗糖、2.5%甘氨酸、0.5%葡萄糖117肉汤中加 入蔗糖和甘氨酸后121°C高压灭菌15min，冷却后加入0.22μπι过滤除菌的葡萄糖至终浓度为 0.5% (质量体积比）。
[0065] 0.5Μ蔗糖/10%甘油：17.115g蔗糖溶解于80ml超纯水中，加入IOml甘油后混匀定 容至100mL，0· 22μηι过滤除菌。
[0066] LB液体培养基：IOg蛋白胨、5g酵母提取物、Ig NaCl溶解于900ml蒸馏水中，调节pH 值至7.0后，定容至IL后121°C高压灭菌15min。
[0067 ] 主要仪器:高速冷冻离心机、移液器、PCR仪均购于德国Epp endorf公司；核酸电泳 槽、电泳仪、电转化仪购于Bio-Rad公司；凝胶成像仪购于上海天能公司；除菌过滤膜(0.22μ m)购自What Man公司。
[0068]目的基因获得：
[0069] 1.抗菌肽Enterocin P基因由生工生物工程(上海)有限公司合成，两侧加 Sac I和 Hindm的酶切位点并导入大肠杆菌DH5a。如图1所示，为本发明按照质粒提取试剂盒提取由 含目的基因的大肠杆菌DH5a质粒的示意图。
[0070] 2.如图2所示，为本发明的按照TaKaRa Biotech限制性内切酶Sac I和Hindm双酶 切步骤1中提取的质粒的示意图，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的基因片段采用天根 公司DNA回收试剂和操作方法进行胶回收，-20°c保存备用。
[0071] 质粒pMG36e线性化：
[0072] 如图3所示，为本发明的采用TaKaRa Biotech限制性内切酶Sac I和Hindm操作说 明双酶切pMG36e质粒的示意图；如图4所示，为本发明的线性化产物经1%琼脂糖凝胶电泳 图，目的基因片段采用天根公司DNA回收试剂和操作方法进行胶回收，-20°C保存备用。
[0073]回收的目的基因和线性化质粒连接
[0074] 按照TaKaRa Biotech的T4 DNA连接酶试剂盒操作说明书对回收目的基因和质粒 进行连接。
[0075] 实施例2
[0076]制备大肠杆菌DH5a感受态细胞
[0077] I、1 %接种DH5a的LB液体培养基，于37 °C振荡过夜培养；
[0078] 2、取过夜培养菌液1 %接种于LB液体培养基，37°C下振荡培养4h(此时细菌处于对 数生长期），冰上放置IOmin;
[0079] 3、4000g，4°C离心10min收集对数期细胞，弃上清，收集细菌细胞沉淀；
[0080] 4、用1/10于之前液体培养基体积的预冷的0.1 M CaCl2菌体，冰上放置30min;
[00811 5、4000g，4°C离心5min弃上清，收集细菌细胞沉淀；
[0082] 6、用1/100于之前液体培养基体积的含0.1 M CaCl2溶液重悬菌体；
[0083] 7、吸取200yL分装于离心管，-80 cC保存。
[0084] 实施例3
[0085]连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞
[0086] (1)取100μΙ E.coli DH5a感受态细胞，加入10-50μ1连接产物，轻柔混匀后，冰浴 30min；
[0087] (2)将EP管放入预热至42 °C的水浴中90s;
[0088] (3)快速将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2min;
[0089] (4)每管加900μ1 LB培养液体基，37°C摇床温和震荡培养1.5h，使细菌复苏并充分 表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；
[0090] (5)吸取100μΙ复苏培养菌液分别涂布于含200yg/mL红霉素的LB培养基平板上；
[0091] (6)将平板置于室温至液体吸收，倒置平板，如图5所示，为本发明的37°C培养12-24h直至出现单菌落图。
[0092] 实施例4
[0093] 大肠杆菌DH5a重组质粒菌落PCR及双酶切鉴定
[0094] 挑取上步骤获得的单菌落进行PCR鉴定
[0095] 用于PCR扩增的引物
[0096] 正向引物:AAGTTGATGCAGCTACGC
[0097] 反向引物：TGTCCCATACCTGCCAAA [0098]扩增目的片段长度为142bp。
[0099] 以单菌落为DNA模板的PCR反应体系如下： 正向引物（10 PM) I HL 反向引物（?ο μΜ) 1 μι dMTP Mixture 2 M-L
[0100] 10 X PCR Buffer 2* 5 I1L Taq DM 聚合酶（5 U/A) 0.2 μL CidH3O 补足至 25AL
[0101] 扩增程序：94°(：，511^11，然后30个循环（94°(：，11^11;58°(：，503 ;72°(：，11^11);72°(：延 伸10min。如图6所示，为本发明的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0102] 重组质粒酶切鉴定：
[0103] 挑取经PCR验证正确的单菌落于LB液体培养基于37°C振荡培养好的菌液，如图7所 示，为本发明的按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒后进行1%琼脂糖凝胶电泳图； 如图8所示，为本发明的提取质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切酶Sac I和Hindm操作 说明双酶切质粒，产物经1 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0104] 实施例5
[0105] 制备乳酸乳球菌MGl 363感受态细胞
[0106] 1、乳酸乳球菌1 %接种于SGM17 (GM17含0.5M蔗糖，2.5 %甘氨酸），培养至0D600 ? 0·5_0·8;
[0107] 2、5000g，4°C 离心 IOmin 收集菌体；
[0108] 3、用冰预冷的含10 %甘油的0.5M蔗糖的溶液洗涤菌体2次；
[0109] 4、用1/100与之前培养基体积的含10%甘油的0.5M蔗糖溶液重悬菌体，于-80 °C保 存。
[oho]乳酸乳球菌电转化：
[0111] 取2yL经验证正确的重组质粒与40yL感受态细胞混合后，转入预冷的电转杯中，冰 上放置lOmin。电转化条件：电压2000V，电容25yF，电阻200Ω。电击完毕后，立即往电转杯中 加入ImL GM17培养基(含20mM MgCl2,2mM CaCl2)后，30°C静置培养2h，涂布于含5μg/ml红霉 素的GMl 7平板上，如图9所示，为本发明的30°C培养直至出现单菌落图。
[0112] 实施例6
[0113] 乳酸乳球菌MG1363重组质粒菌落PCR及双酶切验证
[0114] 挑取上步骤获得的单菌落进行PCR验证
[0115] 用于PCR扩增的引物
[0116] 正向引物:AAGTTGATGCAGCTACGC
[0117] 反向引物：TGTCCCATACCTGCCAAA
[0118] 扩增目的片段长度为142bp。
[0119] 以单菌落为DNA模板的PCR反应体系如下： 正向引物（】〇 _) 1 μL 反向引物（10 μΜ ) I ML dNTP Mixture 2 M-L
[0120] IOXPCR Buffer 2. 5 M-L Taq DNA 聚合酶（：5 ?/UL) 0. 2 μL ddH,0 补足至 25 μι>
[0121] 扩增程序：94°(：，511^11，然后30个循环（94°(：，11^11;58°(：，503 ;72°(：，11^11);72°(：延 伸I Omin。如图10所示，为本发明的PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。
[0122] 挑取经PCR验证正确的单菌落于GM17液体培养基于30°C振荡培养好的菌液，如图 11所示，按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒后进行1%琼脂糖凝胶电泳图；图12所 示，为本发明的提取质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切酶Sac I和Hindm操作说明双酶 切质粒，产物经1 %琼脂糖凝胶电泳图。
[0123] 实施例7
[0124] 乳酸乳球菌MG1363重组菌的分泌表达
[0125] 将含pMG36e-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌MG1363的基因工程菌接种于含 红霉素的GM17培养液中，30°C静置培养过夜。次日以5%接种量转接至20ml GM17培养液中， 30 °C继续静置培养时间为5-6h至细菌对数生长期后，将培养液冰浴IOmin，4 °C 5000rpm，离 心5min收集培养液上清，将获得的上清液进行0.22μπι过滤获得诱导后的无菌上清液，用于 下一步的抑菌实验。
[0126] 实施例7
[0127] 重组抗菌肽抑菌实验
[0128] 1.重组抗菌肽抑菌实验
[0129] 本实验采用琼脂扩散法对重组表达的抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测。 将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌培养物各取IOOyL涂布与20ml固 体培养基中，再用8mm的打孔器打孔，加入200yL的待测样品上清液，以不含有抗菌肽 Enterocin P基因的空载体乳酸乳球菌上清为对照，37 °C培养观察。
[0130] 2.抑菌实验结果
[0131] 采用琼脂扩散法对重组抗菌肽的抑菌活性进行检测，经37°C培养后，结果显示，如 图13所示，为本发明Enterocin P对李斯特菌的抑菌效果图；如图14所示，为本发明 Enterocin P对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；如图15所示，为本发明Enterocin P对沙门 氏菌的抑菌效果图；本发明Enterocin P对三种病原菌均具有抑菌性，对李斯特菌抑制性最 强。本发明的益生型抗菌肽Enterocin P的基因工程菌可在饲料添加剂中应用。
[0132] 根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方 法进行适当的变更和修改。因此本发明并不局限于上面揭示和描述的【具体实施方式】，对本 发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书 使用了一些特定的术语，但是这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
【主权项】
1. 一种抗菌肽Enterocin P基因，其特征在于具有SEQ ID No.l所示的核苷酸序列。2. 权利要求1所述的抗菌肽Enterocin P基因编码的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。3. 权利要求1或2所述的抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因； (2) 构建能高效表达抗菌肽Enterocin P的pMG36e_Enterocin P重组质粒； (3) 用所述pMG36e-Enterocin P重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的基因工 程菌； (4) 利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin P; (5) 对抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测。4. 根据权利要求1所述的抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤（1)中， 人工合成两侧含Sac I和Hindm的酶切位点Enterocin P基因具有SEQ ID No.3所示的核苷 酸序列。5. 根据权利要求3所述的抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤(2)中， 将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列连接与经限制性内切酶Sac I和Hindm双酶切后线性化 的pMG36e质粒连接获得pMG36e-Enterocin P连接产物，将连接产物导入大肠杆菌DH5a，获 得含口]^366411丨61'0〇；[11?重组质粒。6. 根据权利要求3所述的抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤(3)中， 所述宿主菌为大肠杆菌DH5a; 将提取pMG36e-Enterocin P重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化转入 乳酸乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中进行抗菌肽Enterocin P的诱导表达，电转化处理参 数为2. OkV、25yF、200 Ω、5ms，经红霉素抗性筛选、PCR验证、酶切鉴定得到正确的含pMG36e-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌MG1363的基因工程菌。7. 根据权利要求3所述的抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤(4)中， 将含pMG36e-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌MG1363的基因工程菌接种于含红霉素的 GM17培养液中，30°C静置培养过夜;次日以5%接种量转接至20ml GM17培养液中，30°C继续 静置培养时间为5-6h至细菌对数生长期后，将培养液冰浴lOmin，4°C5 OOOrpm，离心5min收 集培养液上清，将获得的上清液进行〇.22μπι过滤获得诱导后的无菌上清液，得到抗菌肽 Enterocin Ρ〇8. 根据权利要求5所述的抗菌肽Enterocin Ρ的制备方法，其特征在于:在步骤(5)中， 采用琼脂扩散法对上清液的抑菌活性进行检测，经37°C培养后，抗菌肽Enterocin P对金黄 色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌或沙门氏菌的抑菌活性进行检测。9. 权利要求2-8任一项所述的抗菌肽Enterocin P动物饲料中的应用。10. 根据权利要求9的应用，所述动物饲料为饲料添加剂。
【文档编号】A23K20/195GK105861522SQ201610487420
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】沈城
【申请人】江苏盐城源耀生物科技有限公司