一种荧光增强型硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种荧光增强型硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析化学技术领域。该探针分子的分子式为：C21H14N4O2S，其结构式如式（Ⅰ）所示：。本发明设计的硫化氢荧光探针，制备简单、合成路线成熟，能够对细胞中的硫化氢进行快速准确检测并可以荧光成像，可应用于水环境和生物细胞体系中硫化氢的含量传感检测，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】
一种荧光増强型硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种荧光增强型硫化氢分子荧光探针及其制备方法和应用，属于分析 化学技术领域。
【背景技术】
[0002] 硫化氢（H2S)，在生物体内由酶催化产生，并且在调节人的生理机能方面扮演着 重要的角色。例如，硫化氢可参与血红蛋白改变;参与体内亚硝基类化合物的还原；调节体 内多种酶的功能；调节神经细胞和神经内分泌;舒张血管平滑肌;保护胃黏膜，减小压力的 作用;硫化氢能够有效清除过氧化氢、超氧阴离子、次氯酸、过氧亚硝基等。实验表明硫化氢 能够有效地降低AP诱导的神经细胞毒性。硫化氢与FPG表现为负比例关系，升高二型糖尿病 病人硫化氢浓度也许有助于降血糖。但是，生物体内硫化氢失调则会对机体产生危害，比如 老年痴呆症，唐氏综合症，糖尿病，肝硬化等。所以实现生物体内硫化氢的检测具有极其重 要的意义。
[0003] h2s作为人体内重要的信号分子，在生物体内浓度变化较快，所以探针要有一定的 响应速度，以实现生物体内硫化氢的实时检测。复杂的生物环境会干扰硫化氢检测，尤其是 硫醇的干扰。同时生物体系内还有多种阴离子，都可能对探针的效果产生影响，探针必须具 有高度的选择性。此外，要实现水溶液中硫化氢的高效传感和生物体内细胞成像，所以设计 的硫化氢探针要有低的荧光背景和高的荧光响应信号。
[0004] 目前，多数的硫化氢荧光探针选择性不高，并且对硫化氢检测颜色变化不明显，对 硫化氢响应的荧光信号增强倍数不高，很难实现检测水溶液和细胞内的硫化氢。
【发明内容】
[0005] 针对目前硫化氢分子荧光探针检测所面临的问题和现状，本发明通过分子设计， 合成出一种具有焚光信号强和高选择性的硫化氢分子焚光探针。本专利基于硫化氢对叠氮 具有良好的还原性并结合激发态分子内质子转移(ESIPT)机理设计的硫化氢荧光探针，探 针对硫化氢具有较强的荧光信号的响应（荧光信号强度可以增强400多倍），具有良好的选 择专一性。能够对水溶液中和细胞内的硫化氢进行荧光成像应用。
[0006] 本发明采用以下技术方案： 一种荧光增强型硫化氢分子荧光探针，其特征在于，所述探针分子的分子式为： C21HWN4O2S，其结构式如式（I)所示：
[0007] 一种上述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤： 1) 将leq的邻甲基苯甲酸溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL浓硫酸，加热回流24小时，然 后分离提纯得到化合物1-1;所述化合物1-1结构式如下：
2) 将leq的化合物1-1，leq的NBS和0.05 eq的AIBN溶于乙腈中，加热回流反应过夜，分 离提纯得到化合物1 -2;所述化合物1 -2结构式如下：
3) 将leq化合物1-2与1.2eq的NaN3溶于DMF中，氮气保护，室温回流反应24小时后，分离 提纯得到化合物1 -3;所述化合物1 -3的结构式如下：
4) 将leq化合物1-3溶于四氢呋喃中，再加入少量甲醇、水和5eq的LiOH，氮气保护，室温 反应17小时，将反应液用3M盐酸溶液酸化，然后分离提纯得到化合物1-4;所述化合物1-4结 构式如下：
5) 将leq水杨醛与leq邻氨基苯硫酚，leq的Na2S205溶解在DMF中，氮气保护，加热回流反 应2-3小时，反应完全后，分离提纯得到化合物2-1;所述化合物2-1的结构式如下：
6)将leq化合物2-1与leq的化合物l-4，leq的DMAP，leq的DCC溶于二氯甲烷中，氮气保 护，室温反应8小时，分离提纯得到目标探针化合物FN3_H2S。
[0008] 所述步骤1)中分离提纯方法为:反应液中加入适量水，用二氯甲烷萃取，水洗2-3 次，盐水洗2-3次，无水硫酸钠干燥，然后柱色谱分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1:1。
[0009] 所述步骤2)中分离提纯方法为:柱色谱分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1: 1〇
[0010] 所述步骤3)中分离提纯方法为：乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，盐水洗涤2-3次，无 水硫酸钠干燥，柱色谱分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1:2。
[0011] 所述步骤4)中分离提纯方法为:用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，盐水洗1次，无水 硫酸钠干燥，柱色谱分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1:2。
[0012] 所述步骤5)中分离提纯方法为:反应液倒入大量水中产生固体，然后减压过滤，真 空干燥，得到纯产品。
[0013] 所述步骤6)中分离提纯方法为:柱色谱分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1: 1〇
[0014] 上述的硫化氢荧光探针的合成路线如下：
本发明所述的硫化氢分子荧光探针的应用，该荧光探针可以应用于水环境和生物细胞 体系中硫化氢的含量传感检测;所述的传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检 测。
[0015] 本发明的优点：（1)探针的合成路线相对简单，且后处理过程容易；（2)本发明实现 了硫化氢分子探针的快速检测，具有选择性好、抗干扰能力强的特点。此外，用肉眼就可以 明显的观察到溶液颜色的变化和紫外灯下较强荧光变化，是一种具有生色传感功能的荧光 探针。其显著的颜色和荧光强度变化，使该探针展现了在水溶液中和生物细胞内高选择性， 高灵敏度检测硫化氢分子，可进行实时定性及定量的目视比色法检测。故而，本发明是一种 简单，快速，灵敏的硫化氢分子特异性检测试剂，在生物分子检测领域具有广阔的应用前 景。其性能将在实施例中结合附图给予详细说明。
【附图说明】
[0016] 图1是实施例1中探针FN3-H2s的1H NMR图谱； 图2是探针FN3-H2S随硫化钠的加入荧光谱图的变化情况； 图3是探针FN3-H2S对不同离子和分子的选择性荧光谱图； 图4是探针FN3-H2S对不同离子和分子的选择性柱状图数据； 图5是探针FN3-H2S溶液在Na2S加入前后溶液颜色的变化； 图6是探针FN3-H2S溶液在Na2S加入前后溶液用紫外灯照射后荧光强度的变化； 图7是探针FN3-H2S对外源性硫化氢进行生物细胞成像。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限 制，实施例中化合物的号码对于上述方案中化合物的号码。
[0018] 实施例1 化合物FN3-H2s硫化氢荧光探针的合成 (1)化合物1-1的合成：
将邻甲基苯甲酸(5.0g，36.7mmol，leq)溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL浓硫酸，加热 回流24小时，用TCL板检测反应，反应完全后，冷却，加入20mL水，用二氯甲烧萃取，水洗2-3 次，盐水洗2-3次无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗 粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1，产量为89%。
[0019] ⑵化合物1-2的合成：
将化合物 1-1(1.97g，12mmol，leq)，NBS(2.35g，13.2mmol，leq)，AIBN(98.4mg， 0.6mmol，0.05 eq)溶于20mL乙腈中，加热回流反应过夜，用TCL板检测反应，反应完全后， 减压旋干溶剂后得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比 为二氯甲烷/石油醚=1:1，产量为56%。
[0020] (3)化合物1-3的合成：
将化合物1-2(1.18,4.53!11111〇1，169)溶于311^01^中，然后加入叠氮化钠（35311^， 5.43mmol，1.2eq)，氮气保护，室温反应24小时，用TCL板检测反应，反应完全后，乙酸乙酯 萃取2次，水洗2-3次，盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用硅 胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:2,产量为 82%〇
[0021] (4)化合物1-4的合成：
将化合物1_3(90〇11^，4.41]11]1〇1，169)溶于1〇1111^1'冊中，加入2 1111^甲醇，4 1]11^水，然后再 加入LiOH( 528mg，22mmol，5eq)，氮气保护，室温反应17小时。用TCL板检测反应，反应完全 后，将反应液用3M盐酸溶液酸化，用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，盐水洗1次，无水硫酸钠 干燥，减压旋干溶剂后得粗产品，并用硅胶柱进行分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂 配比为二氯甲烷/石油醚=1:2，产量为86%。
[0022] (5)化合物2-1的合成：
将水杨酸（961mg，7.87mmol, leq)和Na2S2〇5(1.5mg，7.87mmol, leq)溶于 10mL DMF中， 然后再加入邻氨基苯硫酚（1. 〇g，7.87mmol，leq)，氮气保护，加热回流反应2-3小时，用TCL 板检测反应，反应完全后，冷却，将其倒入200mL水中，有固体产生，减压过滤，真空干燥，得 到纯产品。产量为92%。
[0023] (6)化合物FN3_H2S的合成：
将化合物 1-4(9 .lmg，0.528mmol，leq)，化合物2-1( 100mg，0.528mmol，leq)，DMAP (201mg，0.528mmol，leq, DCC(136mg，0.528mmol，leq)溶于5mL二氯甲烷中，氮气保护，室 温反应8小时，用TCL板检测反应，反应完全后，减压旋干溶剂后得粗产品，并用硅胶柱进行 分离，硅胶颗粒大小为200-300目，洗脱剂配比为二氯甲烷/石油醚=1:1，产量为81%。该探针 的 1H-NMR (400MHz，DMS〇-t/6)(见图 1)δ 8.40 (d，/= 7.4 Hz, 1H)，8.31 (d，/= 7.5 Hz, 1H), 8.09 (d, /= 7.8 Hz, 1H), 7.83 (dd, /= 19.6, 7.6 Hz, 2H), 7.71 (dd, /= 15.9, 7.5 Hz, 3H), 7.58 (t, /= 7.5 Hz, 2H), 7.54 - 7.48 (m, 1H), 7.44 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 4.84 (s, 2H) 实施例2 化合物FN3-H2S硫化氢荧光探针随Na2S加入当量的增加荧光谱图的变化 取实施例1制备的FN3-H2S硫化氢荧光探针溶于二甲基亚砜(DMSO)中，制成lmmol/L储 备液。从储备液中取出40yL加入到5mL的离心管当中，用PBS缓冲溶液(0. lmo 1 /L，pH=7.4) 与DMSO体积比为3 :1的溶液稀释至4 mL，加入不同当量（0-100 eq)的Na2S标准溶液，以 410nm为激发光测量其荧光性质。荧光光谱如图2所示。由图2可见，随着Na 2S加入当量的增 加荧光强度逐渐增强。
[0024] 实施例3 化合物FN3-H2s荧光探针对不同分子或离子的选择性 从实施例2中荧光探针储备液中取出40yL加入到5mL的离心管当中，用PBS缓冲溶液 (0.1mol/L，pH=7.4)与DMS0体积比为3:1的溶液稀释至4 mL，配制一系列探针溶液，分别加 入等摩尔量的竞争分子和等摩尔量的硫化钠标准溶液，其中一个溶液不加离子作为空白对 照，lh后以410nm为激发光检测溶液的荧光发射光谱变化，结果如图3和图4所示。由图3和 图4可以发现，其他离子对化合物FN 3-H2S的荧光几乎没有影响，而硫化钠溶液的加入使化 合物FN3-H 2S的荧光显著增强。
[0025] 实施例4 化合物FN3-H2s荧光探针对硫化氢的可视化检测 从实施例2中荧光探针储备液中取出40yL加入到5mL的离心管当中，加入100摩尔当 量的硫化钠标准溶液，硫化钠可以使合物FN3-H2S荧光探针的PBS: DMS0体积比为3:1的缓冲 溶液溶液发生明显的颜色变化，溶液颜色从无色变成浅黄色（图5)。伴随着紫外灯下肉眼可 视的硫化氢诱导荧光探针发出明亮的蓝色荧光（图6)，说明是一种具有生色传感功能的荧 光探针。
[0026] 实施例5 化合物FN3_H2S荧光探针对细胞外源性硫化氢荧光成像 我们将本发明探针应用于HeLa细胞中对外源性的硫化氢进行荧光成像应用。具体操作 步骤如下:将5μΜ探针DMS0溶液加入到育有HeLa细胞的培养液(2mL)中在二氧化碳培养箱中 培养30 min后用共聚焦显微镜进行蓝通道成像，结果见图7。首先进行明场成像，可以看到 细胞大致的轮廓（图7a)。然后用405nm的激光进行激发成像，探测器接受范围为425nm-475nm，通过蓝通道进行荧光成像可以观察到在未加入似以前，几乎观察不到细胞有荧光发 射（图7b)。然而向体系中加入Na 2S 20μΜ的水溶液后，等待30 min后，再用405nm的激光进行 激发可以观察到细胞内有明显的蓝光发出（图7e)，说明此荧光探针可以对外源性的硫化氢 进行荧光成像。
【主权项】
1. 一种荧光增强型硫化氢分子荧光探针，其特征在于，所述探针分子的分子式为： C21HwN4O2S，其结构式如式（I)所示：2. -种权利要求1所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步 骤： 1) 将Ieq的邻甲基苯甲酸溶于25mL乙醇中，然后加入1.2mL浓硫酸，加热回流24小时，然 后分离提纯得到化合物1-1;所述化合物1-1结构式如下：2) 将Ieq的化合物1-1，Ieq的NBS和0.05 eq的AIBN溶于乙腈中，加热回流反应过夜，分 离提纯得到化合物1 -2;所述化合物1 -2结构式如下：3) 将Ieq化合物卜2与1.2eq的NaN3溶于DMF中，氮气保护，室温回流反应24小时后，分离 提纯得到化合物1 -3;所述化合物1 -3的结构式如下：4) 将Ieq化合物1-3溶于四氢呋喃中，再加入少量甲醇、水和5eq的LiOH，氮气保护，室温 反应17小时，将反应液用3M盐酸溶液酸化，然后分离提纯得到化合物1-4;所述化合物1-4结 构式如下：5) 将Ieq水杨醛与Ieq邻氨基苯硫酚，Ieq的Na2S2O5溶解在DMF中，氮气保护，加热回流反 应2-3小时，反应完全后，分离提纯得到化合物2-1;所述化合物2-1的结构式如下：6)将Ieq化合物2-1与Ieq的化合物1-4, Ieq的DMAP，Ieq的DCC溶于二氯甲烷中，氮气保 护，室温反应8小时，分离提纯得到目标探针化合物FN3-H2S。3. 根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中 分离提纯方法为:反应液中加入适量水，用二氯甲烷萃取，水洗2-3次，盐水洗2-3次，无水硫 酸钠干燥，然后柱色谱分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1:1。4. 根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中 分离提纯方法为:柱色谱分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1:1。5. 根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中 分离提纯方法为：乙酸乙酯萃取2次，水洗2-3次，盐水洗涤2-3次，无水硫酸钠干燥，柱色谱 分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1:2。6. 根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中 分离提纯方法为：用二氯甲烷萃取2次，水洗2-3次，盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，柱色谱分 离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1:2。7. 根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中 分离提纯方法为:反应液倒入大量水中产生固体，然后减压过滤，真空干燥，得到纯产品。8. 根据权利要求2所述的硫化氢分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中 分离提纯方法为:柱色谱分离，洗脱剂配比为二氯甲烷:石油醚=1:1。9. 一种权利要求1所述的硫化氢分子荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针可以 应用于水环境和生物细胞体系中硫化氢的含量传感检测;所述的传感检测包含荧光检测， 目视定性检测，细胞成像检测。
【文档编号】G01N21/64GK105884713SQ201610264719
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】林伟英, 任明光, 邓贝贝
【申请人】济南大学